酶4公开课课件

第四章酶Enzyme

第五节酶的作用机理一、酶的活性中心二、酶作用的专一性三、酶高效性的作用机理四、酶活性的调节控制和调节酶五、同工酶一、酶的活性中心与必需基团（一）酶的活性中心酶是生物大分子，相对分子质量很大，而与酶反应的底物一般是相对分子质量较小的分子，有时即使是大分子底物时，反应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中的一小部分作用。与底物接触并且发生反应的部位就称为酶的活性中心(activecenter)。酶的活性中心往往是若干个在一级结构上相距很远，但在空间结构上彼此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有一定空间结构的区域，该区域与底物相结合并将底物转化为产物，对于结合酶来说，辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。酶的结构与功能的关系（二）酶活性中心证明方法

1、切除法对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。酶的活性中心根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价修饰。此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标准是：①酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；②底物或竞争性抑制剂保护下可防止修饰剂的抑制作用。（1）非特异性共价共接修饰：酶的活性中心修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸，结构见P118）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。（2）特异性的共价修饰：酶的活性中心3、X—射线衍射法：把一纯酶的X—射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。4、亲和标记法：根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为：N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N-对甲苯磺酰-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），结构见P119。其分子中的氯甲基酮部分可使酶的His57烷基化形成酶－TPCK衍生物而使酶失活。5、定点诱变法：通过基因突变的方法研究酶活性中心的必需氨基酸。酶的活性中心1、底物和酶的邻近效应与定向效应2、底物形变和诱导契合的催化效应3、酸碱催化酸碱催化胰凝乳蛋白酶通过酸碱催化使肽键断裂酶分子部分功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用Specificacid-basecatalysisGeneralacid-basecatalysis影响酸碱催化反应速度的两个因素⑴酸碱强度(pK值）组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒3、酸碱催化酶部分残基侧链作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N：底物亲电中心：磷酰基（P=O）酰基（C=O）糖基（Glu-C-OH）4、共价催化金属酶（metalloenzyme):Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金属-激活酶（metal-activatedenzyme):Na+、K+、Mg2+、Ca2+（1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷5、活性中心金属离子的催化作用常见酶的催化机理丝氨酸蛋白酶的作用机理

Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O

-=ActiveSerH–NNCCCHHCH2Ser195His57Asp102-

O–CH2OC–O–H=NN–HCCCHHCH2丝氨酸蛋白酶家族具有类似的Ser-His-Asp催化三联体（电荷中继网）P405组氨酸的咪唑基受pH影响大H–NNCCCHHH+pH6pH7+H–NN–HCCCHHInactive+Ser195His57Asp102H–O–CH2OC–O

-=H–NN–HCC-HCCH2HAsp102His57Ser195CatalyticTriadHHChymotrypsin顺序式催化反应A1NCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COChecksubstratespecificityAsp102His57Ser195HHNCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COFirstTransitionStateChymotrypsin顺序式催化反应A2HHNCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COAcyl-EnzymeIntermediateChymotrypsin顺序式催化反应A3HN-HCCN[HOOC]HOCCNCC[NH2]COHOHAcyl-EnzymeWaterIntermediateChymotrypsin顺序式催化反应D1HOOCCNCC[NH2]CHSecondTransitionStateOHChymotrypsin顺序式催化反应D2HOCCNCC[NH2]COOH脱酰作用DeacylationHChymotrypsin顺序式催化反应D3酶可使用类似的反应基质

O-CN-

H

O-CO-PeptidebondEsterbond

OCH3–C–O––NO2NitrophenolacetateHO––NO2

OCH3–C–OHHartley&KilbyChymotrypsin+H2O硝基酚Nitrophenol醋酸盐Acetate专一性的形成■

Trypsin一族：

chymotrypsin,elastase...

Serineprotease

→

催化机制相同专一性不同●

改变专一性结合区可改变基质专一性

[Science]

chymotrypsin(Ser189)→

trypsin(Asp189)演化Ser蛋白酶家族的专一性不同

p408COO-CAsp活性中心的底物结合部位不同，底物专一性也不同。TrypsinChymotrypsinElastase切Lys,Arg切Trp,Phe,Tyr切

Ala,GlyNon-polarpocketDeepandnegativelychargedpocketShallowandnon-polarpocket

OO–C–N–C–C–N–

C

C

C

C

NH3+

OO–C–N–C–C–N–

C

OO–C–N–C–C–N–

CH3DivergentevolutionAsp--His--SerAsp--His--SerConvergentevolution分子演化TrypsinChymotrypsinElastaseThrombinPlasmin