基因工程final课件

第二章

基因工程参考书:1.《基因工程》孙明高等教育出版社2.《基因工程原理》吴乃虎科学出版社3.《分子克隆实验指南》J.Sambtook,EFFrish,TManiatis.金冬雁等译，科学出版社4.英国PrinciplesofGeneManipulation5.《基因操作原理》中文版瞿礼嘉、顾红雅译高等教育出版社原理：通过基因重组,让目的基因在受体细胞中高效稳定表达。操作水平：DNA分子水平结果：定向地改造生物的遗传性状，获得所需要的品种。利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，经连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞（转化），以期获得基因表达的过程。什么是基因工程?

血液供血者受血者注射器

目的基因供体受体载体

基因工程（打比方）将供体或在细胞外产生的核酸（物质）分子插入到病毒(virus)、质粒(plasmid)或其它载体系统(vectersystem)中从而形成一种新的可连续繁殖的有机体再整合到那些本来不含该类物质的宿主(host)—受体中基因工程的诞生与发展20世纪70年代，PaulBerg及其同事第一个创造重组DNA分子PaulBerg基因工程的诞生与发展1975，发现分子克隆工具酶利用限制性内切酶（Restriction

endonuclease）切割产生特殊DNA片段的能力使得纯化那些DNA片段成为可能基因工程的诞生与发展1978年，重组胰岛素1979年，人类生长激素基因工程的诞生与发展什么是基因?编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。DNA

exon1intron1exon2intron2exon3intron3exon4

转录

Pro-mRNAexon1intron1exon2intron2exon3intron3exon4mRNA剪接翻译蛋白质

真核生物中蛋白质合成过程中外显子和内含子的关系

生物进化的分子基础—基因用进废退，获得性遗传达尔文进化论拉马克进化论过度繁殖，生存斗争遗传和变异，适者生存

基因具有相同的物质基础基因是可切割的基因是可转移的多肽与基因之间有对应关系遗传密码通用基因可以复制遗传基因工程研究的理论依据3‘起始密码子5‘腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）鸟嘌呤（G）（1）获得目的基因；

（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；

（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；

（4）对转化子筛选和鉴定；

（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组DNA操作一般步骤生物材料mRNADNARNAcDNA文库基因组文库人工合成目的基因克隆载体受体细胞重组DNA克隆子转基因生物基因工程操作的工具限制性核酸内切酶将目的基因片断从受体细胞内提取，需要基因的剪刀—限制性核酸内切酶。将目的基因与质粒DNA连接，需要基因的针线—DNA连接酶。将目的基因运入大肠杆菌，需要基因的运输工具—运载体。

限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）定义是一类能识别双链DNA中特殊的核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。类型Ⅰ型限制酶Ⅱ型限制酶III型限制酶不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列限制性内切酶的命名Ⅱ型限制酶的特性

识别序列<6个：如：AsuⅠ5’-GGNCC-3’（5个）

MboⅠ5’-GATC-3’（4个）>6个：如：NotⅠ5’-GCGGCCGC-3’（8个）＝6个（大多数）：如：EcoRⅠ5’-GAATTC-3’有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。

如：Sau3A识别：GATC

BamHⅠ识别：GGATCC有的限制酶识别多种核苷酸序列。

如：HindⅡ识别4种核苷酸序列：5’-CTPyPuAC-3’

（Py→嘧啶碱基C或T；Pu→嘌呤碱基A或G）(a)5’－P单链延伸的粘性末端(b)3’－OH单链延伸的粘性末端①粘性末端（粘端）－GAATTC－－CTTAAG－GAATTCCTTAAG如：EcoRⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’－CTGCAG－－GACGTC－CTGCAGGACGTC如：PstⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；Ⅱ型限制酶的切割类型

②平头末端（平端）－CCCGGG－－GGGCCC－CCCGGGGGGCCC如：SmalⅠ5’3’5’3’5’3’5’3’各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端；Ⅱ型限制酶的切割类型

同裂酶（isoschizomer）

有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ（a）切点位置相同CCCGGGGGGCCCCGGGCCCCGGGC+XmaⅠCCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC+SmaⅠ（b）切点位置不相同同裂酶（isoschizomer）

有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。单酶切法双酶切法部分酶切DNA分子片段化天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。Hind

IIISalI1、具有互补粘性末端片段的连接2、具平末端DNA片段之间的连接3、DNA片段末端修饰后进行连接4、DNA片段加杆后连接

DNA片段连接DNA连接酶

E.coliDNA连接酶只能催化互补粘性末端之间的连接DNA连接酶（DNAligase）能催化双链DNA片段紧靠在一起的3‘-OH末端与5’-P末端之间形成磷酸二酯键，使末端连接。

T4DNA连接酶催化互补粘性末端和平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。具有互补粘性末端片段的连接

E.coliDNA连接酶具有互补粘性末端和平末端片段的连接EcoRIEcoRI

T4DNA连接酶末端转移酶+核酸外切酶+DNA片段末端修饰后进行连接核酸外切酶（exonuclease）：在核酸水解酶中，是具有从分子链的末端顺次水解磷酸二酯键而生成单核苷酸作用的酶的修饰作用CTAGAAGC共同的限制性内切酶酶切位点DNA连接酶DNA片段末端加杆后连接外切酶修饰酶切要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体1、条件：②含有限制性内切酶的位点①能自我复制③含有筛选标记，一般为抗性基因或报告基因④能启动外源目的基因的转录和翻译⑤能在宿主细胞内复制并稳定地保存2、种类质粒、噬菌体、病毒、不同DNA片段组合载体

运载体-基因克隆载体质粒是能自主复制的双链环状DNA分子质粒克隆载体大肠杆菌质粒载体可以克隆10kb以下的片段细菌人工染色体克隆载体一般在10kb以下，能承载40kb左右的外源片段。其他种类的载体包括：PCR克隆载体、噬菌体克隆载体、细菌克隆载体、病毒克隆载体、穿梭克隆载体、细菌人工染色体、细菌表达载体、真核表达载体、昆虫细胞载体、酵母表达载体、体外表达载体、荧光蛋白载体、双杂交载体、信号转导载体、siRNA表达载体、热休克载体、报告基因载体、亚细胞定位载体、转座子构建载体、噬菌体展示载体载体种类基因操作的基本步骤获取目的基因形成重组DNA分子将重组DNA分子导入受体细胞4.筛选含有目的基因的受体细胞5.目的基因的表达将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来取出DNA用限制酶切断DNA

目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。提取目的基因的方法1、直接分离基因细胞内总DNA的提取分离程序双链DNA加热至90-95℃变性解旋成为单链DNA，成为互补链聚合反应的模版降温至37-60℃与模版复性结合升温至70-75℃，DNA聚合酶催化引物按5‘-3’延伸，合成模版DNA链的互补链N个循环，达到2n的拷贝数

2、利用PCR扩增目的基因PCR原理

2、利用PCR扩增目的基因引物1目的基因已知序列已知序列引物2PCR扩增含有目的基因的DNA片段1、必须知道待扩增目的基因DNA片段的核苷酸序列2、待扩增片段两端长约20bp的序列已知，3、允许扩增的DNA片段长度一般在1kb以内4、扩增未知序列或长达几千bp的大基因，需要特殊类型的PCR策略5、RT-PCR、免疫PCR、巢式PCR、实时荧光PCR、原位PCR技术等30几种PCR之歌

从前你要扩增DNA，

总有培养大批细胞的重任要你背。

这时有个家伙叫KaryMullis博士的，

他钻出来说体外合成也OK！只消把你的模板混上缓冲液，

再加些引物——

核苷和聚合酶。变性，退火，和延伸。

加热~凉凉~加热~好神奇！！当你想要检测突变，来啊，做PCR吧！

当你想要基因重组，来啊，做PCR吧！

当你想要侦破大案，来啊，做PCR吧！

当你想知道孩子他爹到底是哪个混蛋，来啊，做PCR吧！！！Bio-rad

推出的

ScientistsforbetterPCR

3、人工基因合成法直接合成法：已知某基因的序列的前提下,可以用化学方法合成或用PCR技术扩增获取目的因.(如胰岛素基因)逆转录法:以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’******************磷酸化磷酸化磷酸化退火连接退火连接退火连接粘性末端粘性末端合成的全基因DNA目的基因化学合成全片段酶促法连接示意图目的基因与运载体结合--形成重组DNA提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接用限制酶切割目的基因和用相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。如用质粒作运载体,则选大肠杆菌为受体细胞目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增将重组DNA导入受体细胞并扩增将重组DNA导入受体细胞并扩增将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增转化：外源裸露DNA进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。转染：如果外源DNA分子是病毒或者噬菌体DNA或RT-DNA，那么把此过程也称为转染。化合物诱导转化：感受态细胞电穿孔转化：高电压脉冲产生瞬间通道超声波处理转化：击穿细胞膜形成膜通道脂质体介导转化：磷质双层包裹DNA磷酸钙转染法：动物细胞捕获DNA-磷酸钙沉淀物常用转化法筛选含有目的基因的受体细胞

前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受