X312基因工程的基本操作程序课件

11.2基因工程的基本操作程序专题1基因工程23基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定5编码区非编码区非编码区编码区上游编码区下游终止子启动子与RNA聚酶结合位点补：真核细胞的基因结构外显子内含子不编码蛋白质，有调控作用编码区：非编码区：外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列6结构基因外显子内含子转录、加工修饰成熟mRNA7关于内含子和外显子的说法正确的是（）A.内含子和外显子在转录的过程中都能够转录成成熟的mRNA

B.只有外显子能够转录成mRNA，tRNA，rRNA

C.原核细胞基因中也有内含子和外显子

D.由于内含子不能编码蛋白质，故它属于非编码区B9基因文库的分类按照外源DNA片段的来源：从特定组织提取的染色体基因组DNA --基因组DNA文库（总）mRNA反转录成的cDNA拷贝--cDNA文库（部分）基因文库的目的为了在不知目的基因序列的情况下，便于获得所需的目的基因。10基因组文库部分基因文库11基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因13模板DNA（已知碱基序列）特异性引物（DNA）耐热DNA聚合酶（Taq酶）

dNTPs（4种脱氧核苷酸）Mg+(促进dNTP与核酸骨架作用)PCR体系基本组成成分14PCR的基本反应步骤变性90-95˚C延伸70-75˚C退火55-60˚C第三步：将反应体系升温至70～75℃，在耐高温的DNA聚合酶催化作用下，将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸合成，产生一条与模板链互补的DNA链。第一步：将反应体系（包括双链模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核糖核苷酸以及酶促反应所需的离子等）加热至90～95℃，使双链DNA模板两条链之间的氢键打开，变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。第二步：将反应体系降温至55～60℃，使两种引物分别与模板DNA链配对结合，这个过程称为复性。15模板DNA95℃5’3’3’5’5’3’3’5’变性1772℃5’3’3’5’5’5’Taq酶延伸11872℃5’3’3’5’5’5’延伸219Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402021模板DNA95℃22PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物23PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶25PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq26PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束29靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环第二步：引物与靶序列退火30靶序列靶序列引物Ⅰ引物Ⅱ5’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNA聚合酶PCR循环第三步：引物延伸31靶序列靶序列第1个PCR循环完成后：得到两个拷贝的靶序列32PCR是针对特定DNA片断的快速体外复制增殖技术每循环一轮，目的基因的量可增加一倍增殖速率为2n,（n为循环次数）每完成一个循环需2-4分钟，2-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。33PCR技术扩增过程a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，

断裂，形成

。

b、复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部

。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的

。氢键单链DNA双链DNA链34从基因文库中获取利用PCR技术扩增利用化学方法人工合成归纳：获取目的基因的方法DNA合成仪DNA序列自动测序仪PCR扩增仪35基因表达载体的构建——核心质粒DNA分子一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种限制酶

目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。36构建表达载体组成目的基因启动子终止子标记基因目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在；可以遗传给下一代；使目的基因能够表达和发挥作用。复制原点插入基因终止子抗生素抗性基因表达载体启动子37将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法38将目的基因导入动物细胞显微注射法（将基因表达载体提纯，用显微仪注射到受精卵中）39将目的基因导入微生物细胞Ca2＋处理受体细胞成为感受态细胞，再进行混合。将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细胞壁和细胞膜的通透性。40目的基因的检测与鉴定检测:是否插入目的基因是否转录是否翻译鉴定:功能活性鉴定抗性鉴定41DNA分子杂交技术DNA-RNA分子杂交技术抗原—抗体杂交技术检验受体细胞染色体的DNA上是否插入了目的基因检验目的基因是否转录出了mRNA检验目的基因是否表达出了蛋白质个体生物学检验个体生物学性状观察42DNA附着在膜上硝化纤维素加探针报告基因（含荧光素分子）变性DNA杂交（如检测SARS病毒等）abcd43①检测是否插入目的基因，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。②检测是否转录出了mRNA，利用DNA分子杂交技术，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。③检测目的基因是否翻译成蛋白质。抗体与蛋白质进行抗原－抗体杂交，看是否有杂交带。④还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。提示：①DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；②抗原－抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。44大量的受体细胞接受不多的目的基因。处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物45归纳:

基因工程的基本操作程序获取目的基因从基因文库利用PCR化学方法人工合成构建基因表达载体目的基因、启动子、终止子、标记基因将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法、显微注射法目的基因的检测与鉴定检测：是否插入、转录、翻译461.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是 2、下列属于获取目的基因的方法的是①利用mRNA反转录形成②从基因组文库中提取③从受体细胞中提取④利用PCR技术⑤利用DNA转录 ⑥人工合成A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥473.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是

A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性B．有利于对目的基因是否导入进行检测C．增加质粒分子的分子量D．便于与外源基因连接4.

有关基因工程的叙述正确的是A．限制酶只在获得目的基因时才用B．重组质粒的形成是在细胞内完成的C．质粒都可作为运载体D．蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料485.哪项不是基因表达载体的组成部分A．启动子B．终止密码

C．标记基因D．目的基因6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法

A．基因枪法B．显微注射法

C．农杆菌转化法D．花粉管通道法49例、采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是，人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。以下有关叙述，正确的是A.人体细胞中凝血因子基因编码区的碱基对数目，等于凝血因子氨基酸数目的3倍B.可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组

DNA分子导入羊的受精卵C.在该转基因羊中，人凝血因子基因存在于乳腺细胞，而不存在于其他细胞中D.人凝血因子基因开始转录后，DNA连接酶以DNA分子的一条链为模板合成mRNAB50

胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？

尝试设计511.答：不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：（1）生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达；（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。思考与探究（P15）522.解析：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中Ti质粒上Vir区（毒性区）基因的诱导物，使Vir区基因活化，导致T-DNA的加工和转移，从而侵染植物细胞。53需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异。如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：①要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；②要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。543.解析：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞