目的基因的获取优秀公开课件

复习题1、-----热稳定性较好，可用来进行特定核苷酸序列的体外扩增；2、-----可以在体外以mRNA为模板合成cDNA；3、为避免载体自连，可以用------将DNA的5’磷酸基团去除。4、----可以去除DNA片段中突出的单链尾巴。5、寄主控制的限制与修饰现象涉及到的两种酶是-----和-------。6、质粒的复制类型可分为——和——两种。7、质粒的三种构型在琼脂糖凝胶电泳中速度最快的是——。8、pUC18/19是——载体。9、pUC118、119是——载体。10、------年被公认为基因工程元年。第四章目的基因的获取第一节化学合成目的基因第二节PCR扩增获得目的基因第三节筛选基因文库获取目的基因第四节转座子标签法获得目的基因第五节图位克隆获得目的基因第六节mRNA差别显示技术获得差异表达的基因第七节酵母双杂交系统获得目的基因应用范围：1）合成PCR引物

2）寡核苷酸探针3）人工接头4）较小的基因固相亚磷酸三酯法一、基本原理二、支持物可控微孔玻璃珠（CPG）三、单体3’位二异丙基亚磷酸酰上的磷酸的羟基用甲基或β-氰乙基保护5’位

二甲氧基三苯甲基（DMT）第四步----盖帽（Capping）封闭未反应的核苷酸单体1

第五步----氧化（Oxidation）三价磷氧化为五价的磷多次循环直到合成所需的长度，用浓氨水将DNA从固相上洗脱下来，真空抽干，样品溶于适量水中进行纯化分析。化学合成的单元操作OHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeHDMT：二甲氧基三苯甲基激活缩合氧化脱取代基可控微孔玻璃珠CPG连接臂五、基因的组装

目前合成能力200b以内，若要合成更长的基因，则需要先合成短的序列，然后再拼接到一起啊，称为基因的组装。5‘5‘目的基因5‘变性加热5‘5‘引物退火5‘5‘底物聚合5‘5‘5‘5‘加热变性5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘5‘退火引物底物聚合加热变性引物退火底物聚合123二、特点：1.反复循环便于获得大量的基因拷贝；2.多用于基因检测，如用于基因重组表达，须进行DNA序列分析。三、逆转录PCR（RT-PCR)mRNAcDNAPCR1、已知目的基因序列的RT-PCR2、从基因编码部分氨基酸序列出发的RT-PCR已知目的基因编码的蛋白N端部分氨基酸序列信息，可以以此设计特异引物，从总RNA中获得目的基因。

N端C端氨基酸序列：ValPheAsnAlaTrpLysAspHis核苷酸序列:GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA(T/C)

引物1引物2简并引物1：GTNTT(T/C)AA(T/C)GCNTGGAA共16种简并引物2：GCNTGGAA(A/G)GA(T/C)CA共16种反义引物：oligo（dT）12-18已知序列

mRNA5’AAAAAA3’TTTTTTT5’(反义引物)

逆转录mRNA5’AAAAAA3’TTTTTTT5’(反义引物)加入简并引物1、变性、退火、延伸

TTTTTTTT5’

引物1AAAAAAA3’加入简并引物2、变性、退火、延伸

AAAAAAA3’

TTTTTTTT5’四、依据基因部分序列信息获得基因全长序列1、反向PCR(inversePCR,IPCR)2、盒式PCR3、RACE技术盒式PCR：是利用cassete（即人工合成的带有适当限制酶的粘性末端较长的双链DNA分子）和cassete上的引物，特异性扩增目的基因组DNA未知区域的一种有效方法。RACE技术：通过PCR技术进行cDNA末端快速克隆的技术。以mRNA为模板逆转录成cDNA第一条链后，用PCR技术扩增出某个特异位点到3’或5‘之间的未知序列的方法，分别称3’-RACE或5‘-RACE。第三节筛选基因文库获取目的基因一、基因组文库的构建二、cDNA文库的构建三、筛选基因文库获取目的基因基因文库（genelibrary）通过克隆的方法将某一基因组DNA或cDNA保存于适当宿主菌或噬菌体中形成转化子群，所有重组DNA序列总和代表该基因组的DNA全部或部分序列。Forexample:

期望值为0.99，插入片断为20kb的

E.coli(4.6×106bp)和human(3×109bp)基因组的克隆数的计算N

E.coli==1.1×103

ln(1-0.99)

ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman==6.9×105

ln(1-0.99)

ln[1-(2×104/3×109)]一、基因组文库（genomiclibrary）的构建1.概念：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。2.基因组文库应具备的条件重组克隆总数不可过大；克隆基因的完整性；部分重叠序列大小合适；克隆片段易于从载体上卸载；重组克隆能稳定保存扩增筛选。3.基因组文库的构建过程1)基因组DNA的制备原则：完整性好、纯度高。AAAA2）基因组DNA的片断化限制性内切酶酶切——部分酶切物理方法：超声波处理、小孔喷射、高速搅拌

3）载体和受体的选择载体承载片段大小受体

plasmid15kb大肠杆菌

λ-DNA23kbλ噬菌体

cosmid45kb大肠杆菌YAC1000kb酵母菌4）DNA片断和载体的连接黏性末端连接效率比平末端高定向连接可以提高重组率防止载体自连5）重组体转化宿主细胞至此，建成了基因组文库的初库6）初库的扩增初库经过扩增形成终库。二、cDNA文库(complementaryDNAlibrary)的构建1、cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）经过重组扩增得到的基因文库。2.特点：长度小,操作方便；便于筛选某一特定功能的基因；利于获得较多的模板；可在原核细胞中表达有生物活性的蛋白；不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同；不能研究基因组的结构功能；3.cDNA文库的构建过程1）mRNA的提取与纯化提取：选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源；纯化：将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸纤维素中进行亲和层析。2）cDNA第一条链的合成以Oligo(dT)为引物，从模板3’末端开始，沿5’→3’方向合成；随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链。mDNAcDNA第一链的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一链引物退火逆转录酶dNTPs

3）cDNA第二条链的合成自身引物法置换合成法引导合成法cDNA第二链的合成（自身引物法）煮沸NaOHAAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1cDNA第二链的合成（置换合成法）

DNApoldNTPsRNaesH5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligase

4）cDNA与载体连接和导入宿主细胞三、筛选基因文库获取目的基因1.核酸分子杂交法2.免疫学筛选法从基因文库中筛选目的基因密集铺板（1-10万）杂交挖取铺板铺板目的重组克隆第四节转座子标签法获得目的基因基本原理转座子插入某一基因或其关键调控基因内部会造成隐性性状表达或产生突变，据此获得含有转座子的纯合体并构建基因组文库，以转座子特异基因为探针筛选阳性克隆，从中得到转座子两侧序列，以之为探针筛选正常的基因组文库获得目的基因。转座子标签法导入

×

转座子

含转座子的显性纯合体AA*隐性纯合体aa突变或隐性表型A*a

×显性表型Aa

aaA*aA*A*

筛选构建基因文库第五节图位克隆获得目的基因图位克隆（mapbasedcloning），又称定位克隆，基于某些生物已制备出精确的遗传图谱。根据一些已知的与目的基因紧密连锁的分子标记可以获得目的基因。一、染色体步移二、染色体登陆一、染色体步移（chromosomewalking）

按照已知的分子标记基因制备探针，与文库杂交得到阳性克隆，再用该阳性克隆内基因末端为探针，再与文库杂交，如此重复，直到350kb以后，得到的阳性克隆为目的基因。已知的分子标记基因350kb未知的目的基因染色体步移的缺点得不到重叠克隆而被打断，前功尽弃遇到重复序列而改变步移方向二、染色体登陆（chromosomelanding）构建插入片段平均长度大于目的基因与其紧密连锁的分子标记之间的距离的基因文库，可以通过筛库直接获得含有目的基因的大克隆，从中分离目的基因，称为染色体登陆。第六节mRNA差别显示技术获得差异表达的基因mRNA差异显示技术（mRNAdifferetialdisplay）：将mRNA逆转录和PCR技术结合起来的一种RNA指纹图谱技术，因此称DDRT-PCR。是一种快速有效的克隆差异性表达基因的方法。原理：用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2-3小时，可显示出50-100条长度在100-500bp之间的DNA条带。3’-锚定引物：

P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。mRNA:5’-N‘M’AAAAAA…AA-3’(12种序列)3’-NMTTTTTTT…TT-5’

5’-随机引物：

10-mer，更好的同第一链结合，从而呈现出更多种的mRNA。一般用20种随机引物和12种3’-端锚定引物组成的全部240组引物对PCR扩增后，所产生的大约