刘宝DNA甲基化课件

表观遗传学创新实验

5’-氮胞苷处理水稻幼苗对基因组

DNA甲基化的影响

庞劲松刘宝

表观遗传学与DNA甲基化DNA甲基化作用DNA的甲基化及其方式DNA甲基化的生物学意义DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成DNA胞嘧啶甲基化检测检测方法：MSAP，bisulfitesequencing5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响实验目的实验材料仪器试剂实验方法5’-氮胞苷处理水稻幼苗植物基因组DNA的提取与纯化基因组DNA酶切-连接接头PCR扩增：预扩增，选择性扩增PAGE电泳预期实验结果注意事项与建议思考题参考文献表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括:X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：

在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录 图3甲基化与基因沉默参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成从头甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。维持甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化状态给新合成的DNA链上加上甲基。图4两种胞嘧啶甲基化方式

DNA胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等

MSAP流程：

提取基因组DNA

（注意发育时期和成长状态相同）

………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……

………TAGGCCACCGAACGGCCTG……

MspI酶切+接头 HapII酶切+接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC

ATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTG

TAGGCCACCGAACGGCCTG

PCR PCR

PAGE电泳 PAGE电泳MspI5’…CC(m)GG…3’3’…GGC(m)C…5’HpaII5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’重亚硫酸盐测序图5重亚硫酸盐测序原理5’氮胞苷处理对水稻DNA甲基化的影响实验目的使用不同浓度的5’氮胞苷溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。实验材料水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)

5’氮胞苷如何影响基因组DNA甲基化水平：5’氮胞苷可以与DNA甲基转移酶（DMT）结合从而抑制其活性，在DNA复制过程中抑制维持甲基化作用，使复制后的DNA甲基化水平降低。试剂植物基因组DNA改良CTAB提取液：bufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LEDTA;bufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;bufferC:5%N-lauroylsarcosinePCR试剂：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，PCR引物预扩增引物： H/M+0:(5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´) EcoRI+0:(5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)选择性扩增引物： H/M+AN:5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3´ EcoRI+AN:5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3´。酶切-连接试剂：EcoRI(NEB)，HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410xreactionbuffer接头：EcoRIadapter:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’ CATCTGACGCATGGTTAA HapII/MspIadapter:5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’ AGTACTCAGGACGAGCPAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝，银染固定/终止液(10%冰乙酸)，染色液(2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml37%甲醛)，显影液(2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC，用时，加入3ml37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。其它试剂：5’-氮胞苷(100mg/mL)，蒸馏水，PVP(20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A(DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λDNA，1xTBE(0.089MTris-borate,0.089MBoricAcid,0.002MEDTA)，3xloadingbuffer(300mMNaOH,97%formamide,0.2%bromophenolblue)。实验方法5’-氮胞苷处理水稻幼苗：26℃，暗培养(1)取水稻Nipponbare种子10粒X4组，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加入15mL蒸馏水浸种24h；（第一天）(2)分为三个实验组和一个对照组，实验组分别用25mg/mL,50mg/mL,100mg/mL5’-氮胞苷溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每天换处理液1次；（第二~十一天）图75’-氮胞苷处理的水稻幼苗（右）和对照植株（左）植物基因组DNA的提取与纯化改良CTAB法(KidwellandOsborn,1992) 不同处理的叶片1g

液氮中研磨成粉 转入50ml离心管

加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)

65℃恒温水浴摇床，40-50rpm振摇90分钟 加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟 4℃3000rpm离心10-15分钟 上层水相

加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底 DNA于70%乙醇中过夜。 DNA沉淀

（第十二天）基因组DNA酶切-连接接头甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟,缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：

T410xbuffer2.5μlBSA(10mg/L)0.1μlEcoRIadaptor(5pM)0.5μlH/Madaptor(50pM)0.5μlEcoRI(20U/μl)0.5μlH/MHpaII(20U/μl)0.25μlMspI(10U/μl)0.5μlT4ligase0.1μlGenomicDNA300ngAFLP-Water补足总反应体积20μl混匀体系，37℃，6小时，8℃，4小时，4℃保存。共四个处理组，即Nipponbare25mg/mL处理组，Nipponbare50mg/mL处理组，Nipponbare100mg/mL处理组，Nipponbare对照组；每组分别用HapII/MspI酶切，共需切8管（第十五天）表2水稻MSAP限制性酶切、连接体系PCR扩增预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：PCR程序：94℃预变性2min,94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒,共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟。根据检测结果，用0.1xTEbuffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。10xPCRreactionbuffer2.5μLdNTPs(2.5mM)2μLEcoRIadaptor+A(5μM)1μLH/Madaptor+0(5μM)1μLTaqDNApolymerase(5U/μL)0.2μLPCRwater16.3μLDNA模板（酶切连接产物）2μLTotalvolume25μL表3AFLP预扩PCR体系水稻AFLP选择性扩增体系如下：按以下参数进行PCR扩增反应：

94℃预变性2分钟,94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，

55℃复性30秒，

72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟。 （第十七天）10xPCRreactionbuffer1.5μLdNTPs(2.5mM)0.6μLEcoRIprimer(5μM)0.6μLH/Mprimer(5μM)0.6μLTaqDNApolymerase(5U/μL)0.12μLPCRwater9.58μLDNA模板（预扩增稀释产物）2μLTotalvolume15μL表4AFLP选扩PCR体系尿素胶配制

灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30μL，10%过硫酸铵（APS）160μl，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。胶聚合1小时以上才可以电泳。电泳：电泳仪采用北京市六一仪器厂DYY-10C型。电泳装置使用北京君意东方电泳设备有限司测序装置新JY-CX2B型。电泳缓冲液为1xTBE，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3xloadingbuffer,混匀，瞬时离心，点样量16μL，恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。尿素(分析纯)16.8g10xTBE4mL40%丙烯酰胺胶贮液(Acrylamide/Bis19:1)16mL超纯水加到总体积40mL灌胶图 电泳图表5PAGE胶配方银染操作电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将 附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇 20分钟，直至指示染料消失。凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水 洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板 从水中取出后，竖起空水15秒。染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。）终止显影，在显影液中直接添加等体积的固定/终止液（第一步中用过的），停止显影并固定影像。固定完全后，即醋酸和碳酸钠反应完全(溶液不再有二氧化碳产生)，用双蒸水洗涤凝胶2次，每次至少2分钟，凝胶板从水中