人类基因组DNA提取课件

人类基因组DNA提取、限制性核酸内切酶切割的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用药学第二讨论小组人类基因组DNA的提取提取方法:1·从全血中提取2·从口腔上皮脱落细胞，发根细胞中提取（全血）操作方法：细胞裂解与RNase/蛋白酶K消化

1.取100μl抗凝全血置于1.5mlEppendorf离心管中，再加入100μl裂解液和20μlRNaseA/蛋白酶K液，用移液器来回吹打混匀，室于55℃温浴35分钟，其间来回颠倒离心管几次，直至溶液呈水溶状。

2.加入10μl3M的NaAc(pH4.8)，随后加入1250μl结合缓冲液，充分振荡混匀，12，000rpm离心30秒。DNA与吸附柱结合

3．用移液器Tip转移上清并加入到离心吸附柱（套好收集管）中，放置1分钟，12，000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液。

注意：待转移上清约1300μl，离心吸附柱容量约650μl，故需每次转移上清650μl到离心吸附柱中，离心，倒掉收集管中的废液，重复实验操作步骤3。DNA的纯化:

4.再加入600μl洗涤缓冲液（washingbuffer）到离心吸附柱（套好收集管）中，12，000rpm离心30秒。

5．重复步骤4一次，12，000rpm离心3分钟以充分除去洗涤缓冲液。

6．小心取出离心吸附柱，弃收集管，将离心吸附柱套入一个干净的1.5mlEppendorf离心管，并加入50μl洗脱缓冲液(elutionbuffer)到离心吸附柱中(洗脱缓冲液一定要加在离心吸附柱的正中)，放置1分钟，于12，000rpm离心30秒。

7．取出Eppendorf离心管，其中便是所提取基因组NA。（口腔上皮脱落细胞）操作方法：1、用舌头舔颊粘膜上颚、用牙刮颊部，嘬咀，用分泌出的唾液反复漱口；将唾液吐到杯中。用生理盐水洗涤，2000rpm离心10分钟，倒掉上清液；重复1次。2、沉淀中加1ml1×细胞核裂解液(STE)，打散细胞团、混匀，再加酶解混合液（含350μlSTE、150μl10%SDS和10μl20mg/ml蛋白酶K），摇匀，至出现粘稠透明状。37℃温箱过夜或50℃3~4小时。3、加等体积饱和酚（或1/3体积的饱和NaCl），轻摇混匀10分钟，室温2000rpm离心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。4、小心移上清至另一离心管（尽量避免吸取中间层），加等体积氯仿混匀5分钟，室温2000rpm离心5分钟。5、重复步骤4一次。6、将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100μlTE中。7、TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。一、概念核酸酶内切酶外切酶限制性核酸内切酶：能识别双链DNA分子内部的特异位点并裂解磷酸二酯键二、分类分类依据：酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及与DNA结合和裂解的特异性特性I类II类III类内切酶的蛋白结构单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶限制和修饰活性3种不同的亚基单一成分2种不同的亚基所需辅助因子ATM,Mg2+,SAMMg2+ATM,Mg2+,SAM寄主特异性位点识别序列EcoB:TGA(N)8TGCTEcoK:AAC(N)6GTGC回文序列（IIs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG切割位点在距离识别位点至少1000pb处随机切开一条单链位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3‘端24-26pb处酶催转换不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点寄主特异性位点识别为甲基化的序列进行切割能能能序列特异的切割不是是是基因工程中的用途无用十分有用作用不大四、切割方法识别和切割位点

4-6个碱基对且具有回文序列的DNA片段大多数酶是错位切割产生5’或者3‘黏性末端例如：EcoRI切割后产生5’黏性末端5‘-G↓AATTC-3’5‘-GAATTC-3'3’-CTTAA↑G-5'3‘-CTTAAG-5'黏性末端平末端有一些酶沿对称轴切断DNA，产生的末端称为平端或钝端例如:SmaI琼脂糖凝胶电泳结果分析

琼脂糖凝胶电泳结果分析

琼脂糖凝胶:天然琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖及琼脂胶组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些集团带有点荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象。什么是琼脂糖凝胶电泳？

琼脂糖凝胶电泳主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂凝胶分子筛作用，核算片段因其分子量或者分子形状不同，电泳速度有差异而分离。这种技术是基因操作的一种方法。琼脂糖凝胶电泳原理:

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移．使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离结果与核酸的分子量、分子构型和凝胶浓度密切相关。实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比。通过比较标准物与未知片段的移动距离便可测出未知片段的大小。但当DNA分子超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难讲它们分开。①

超螺旋DNA：

尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内DNA链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。

②

线性DNA：

当DNA损伤在DNA双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒DNA，这种DNA的泳动速率介于超螺旋与切口质粒DNA之间。③开环DNA：

在质粒DNA复制过程中，拓扑异构酶I会在DNA双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。

一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的电泳迁移率不同。要有效地分离大小不同的DNA片段，需选用适当的琼脂糖凝胶浓度。3）琼脂糖的浓度琼脂糖凝胶电泳的应用。蛋白质和核酸，由于pH的不同带有不同电荷，且在电场中受力大小不同，导致发生泳动的速度不同，最终可将其分离开来。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。电泳的缓冲液中充满了离子，因此可以导电。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。琼脂糖凝胶电泳注意点选择合适的电泳方法琼脂糖凝胶电泳：一般的核酸检测聚丙烯酰胺凝胶电泳：高分辨率脉冲凝胶电泳：DNA链巨大凝胶浓度浓度通常在0.5～2%之间，低浓度的用于大片段核酸的电泳，高浓度的用于小片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。注意：高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。缓冲液:常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注意：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。电压和温度:

电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA电泳，温度应该低于15℃。

注意：如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象

DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计比较准确。需要注意的是Marker的电泳同样要符合DNA电泳的操作标准。核酸染色剂

实验室常用的核酸染色剂是溴化乙锭（EB）

溴化乙锭（EB）：是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射检测琼脂糖中的DNA优点：染色效果好，操作方便缺点：稳定性差，具有毒性。注意：观察凝胶时应根据染料不同使用合适的光源和激发波长，如果激发波长不对，条带则不易观察，会出现条带模糊的现象。DNA样品的纯度和状态样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐，用酚可以去除蛋白。变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也可能出现不规则的DNA条带迁移。用20mMNaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性DNA的上样

正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上样量则导致带信号弱甚至缺失。琼脂糖凝胶电泳操作步骤1制备琼脂糖凝胶2.

胶板制备3.

加样