纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理课件

纤维素酶类糖苷水解酶及其降解机理第四章14.1导言纤维素类生物质是自然界中最丰富的。与淀粉在结构上的差别仅在于糖苷键连接方式不同。多与半纤维素、木素相互结合在一起。纤维素酶系统非复合：真菌、放线菌一般由菌丝分泌到胞外分别发挥作用。复合：厌氧菌（热纤梭菌）在其细胞壁上产生隆起的细胞结构，为纤维小体。2自从1906年在蜗牛消化液中首次发现纤维素酶后，人类对其研究经历了百年历史：1950--木酶的发现，C1-Cx假说。1980年至1988年--利用基因工程的方法对纤维素酶的基因进行克隆和一级结构的测定。90年代--厌氧细菌纤维小体超分子复合体结构功能研究，多结构与体系的发现。21世纪--基因及氨基酸序列，分子时代。导言3(3)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC.3.2.1.21,简称BG）,这类酶水解纤维二糖和短链的纤维寡糖生成葡萄糖。对纤维二糖和纤维三糖的水解很快，随着葡萄糖聚合度的增加水解速度下降。4.2纤维素酶系统的组成54.3糖苷水解酶家族以底物专一性为基础建立的命名方法不能反映酶分子的结构特性。把作用于碳水化合物的相关酶类分成许多蛋白质家族，形成专门的数据库共享。碳水化合物活性酶(CAZy)分类系统，只对结构域进行定义。CAZy中某一基因的结构域以模块表示。67图4.294.4厌氧细菌纤维素酶的结构与功能厌氧细菌在纤维素底物上生长时，在细胞壁上产生隆起的细胞结构即为纤维小体。不同生物体之间纤维小体结构相似，但其组成成分随着种的不同而有所差异。纤维小体结构复杂、体积庞大、异质性强。104.4.1纤维小体的一般组装模式结构蛋白：初级脚手架蛋白，锚定脚手架蛋白等催化模块：纤维素酶、半纤维素酶等114.4.1纤维小体的一般组装模式134.4.2粘连模块与对接模块4.4.2.1粘连模块不同厌氧微生物的粘连模块序列差异很大。同一个脚手架蛋白上的粘连模块一般为同一类型，不同粘连模块之间有不同的序列相似性。目前型和型粘连模块晶体结构已测定。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能1415174.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用

决定了纤维小体的结构，并纤维小体各亚基的整合仅依赖于此。主要以疏水作用相联系，并辅以相对较少的分子间氢键。热纤梭菌中Ⅰ型粘连模块与对接模块的相互作用是目前已知最强的蛋白质间相互作用之一。

厌氧细菌纤维素酶的结构与功能18粘连模块与酶上对接模块在种内的结合是非专一性的，而在种间的相互作用却是专一性的。生化水平上，包含对接模块的酶与包含粘连模块的脚手架间的结合本质上是非特异性的。对接过程中粘连模块总体结构本质上不变，对接模块发生了构象变化。4.4.2.3粘连模块和对接模块相互作用

194.4.3纤维小体上的催化模块以热纤梭菌为例，它既有纤维小体酶系，也有游离的非纤维小体酶。区别纤维小体酶与游离酶的关键特征是，纤维小体酶带有对接模块。催化模式具有多种情况：热纤梭菌中，表现为葡聚糖内切酶活性、持续降解的纤维素内切酶活性、纤维素外切酶。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能214.4.3.1典型的纤维小体外切酶（或持续性内切酶）的空间结构

厌氧细菌纤维素酶的结构与功能22厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.3.2典型的纤维小体内切酶的空间结构

Figure4.4.3Structuralcomparisonof(α/α)6glycosylhydrolases

23酶上的CBM不是保持酶复合体接近底物表面所必需的结构。然而其具有潜在的功能，似乎是单个酶专一性结合底物，特别是其在分子水平上结合单个底物分子链（如可溶性的β-葡聚糖或木聚糖链）。酶分子模块上的CBM既有A型也有B型。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.4.2酶分子的CBM

254.4.4.3纤维小体和游离酶上的CBM比较

CBM蛋白质的种类及其所属家族都是高度不同的。但部分在纤维小体和游离催化系统中是相同的。有些只存在于游离催化系统，而在纤维小体中完全不存在。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能26图4.5厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性29厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性30厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.5纤维小体的多样性314.4.6纤维小体基因在基因中的分布规律厌氧细菌纤维素酶的结构与功能324.4.7微型人造小体的研究进展纤维小体实际上是一个微型而高效的纤维素降解机器。现在已提出了通过理性人工设计并通过工程手段提高天然纤维小体降解活力的新思路。可行性依据：1）对于细菌的粘连模块和对接模块，无论是单独生成还是移植到异源性的蛋白质上，它们都能忠实地保持自身的生物学性质。2）二者高亲和力相互作用在一些产纤维小体的细菌种类之间具有物种专一性。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能33与天然纤维小体相比，有三个主要的不同之处：1）含有酶的数量有限。2）是同源性的。3）每个酶在微型手脚架蛋白上的位置是受到控制的。未来前景包括构建新的杂交手脚架蛋白，使之能够将三个或多个不同的酶结合到特定位点上。嵌合体的稳定性也是影响它将来工业化应用的一个因素。厌氧细菌纤维素酶的结构与功能4.4.7微型人造小体的研究进展344.5好氧真菌纤维素酶的结构与功能好氧真菌分泌的纤维素酶分子一般都由一个糖基化的连接肽将一个较大的催化结构域和较小的纤维素结合结构域连接起来构成。354.5.1催化结构域及催化断键机理纤维素酶催化断键功能相似，但属不同糖苷水解酶家族。T.reesei是纤维素酶体系研究最为深入的好氧真菌。其中CBHI是该菌所产主要的外切酶。催化中葡聚糖异头碳的构型并不发生变化。水解主要产物是纤维二糖。好氧真菌纤维素酶的结构与功能36好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.1催化结构域及催化断键机理37图4.9好氧真菌纤维素酶的结构与功能38有待研究的问题：1.结晶纤维素表面如何游离出单根葡聚糖分子链。2.单根葡聚糖链如何快速准确地进入CBH的催化孔道中。

3.葡聚糖链如何在催化孔道中高效地持续性单方向运动。4.5.1催化结构域及催化断键机理好氧真菌纤维素酶的结构与功能394.5.2纤维素结合结构与的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能当多个不同蛋白质中都存在一个相同或相似的结构域时，该结构域称之为模块。每一纤维素酶分子包含催化模块和碳水化合物模块（CBM）。基于结构和功能，将不同CBM分成三类：40好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2纤维素结合结构与的结构与功能41CBM的功能推测其功能是将催化结构域拉近到不溶性的纤维表面，使纤维素水解过程易于进行。但是其功能及催化中的分子机理仍未形成共识。好氧真菌纤维素酶的结构与功能4.5.2纤维素结合结构与的结构与功能424.5.3链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能纤维素酶的模块结构通常由韧性的糖基化连接区连接在一起。其有效长度及柔韧性也是酶催化过程的关键。富含脯氨酸、苏氨酸和甘氨酸。434.5.3链接区的结构与功能好氧真菌纤维素酶的结构与功能虽然许多结构域三级结构已得到解析，但目前还没有一个包含完整纤维素酶的三维结构获得解析。444.6纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程

结晶纤维素的降解是纤维素降解的关键限速步骤。持续性作用的外切纤维素酶是降解结晶纤维素的主要酶类。可分为两个过程：纤维素结晶超分子结构的破坏。（需外加能量）糖苷键的断裂。（为酶催化反应，是动力学过程）454.6.1纤维素酶分子-底物之间的结合过程纤维素酶通过结合结构域吸附到底物上；定位于底物表面上特定的化学键上；形成酶-底物复合物；β-糖苷键的水解，同时酶分子沿着纤维素链前进；纤维素酶从底物脱吸附，或重复第4步，当催化结构域离开纤维素链时重复第2、3步；β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖形成葡萄糖。

反应过程存在产物的抑制，及底物结构变化对酶分子催化过程的影响等因素。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程464.6.2外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程4.6.2.1酶分子-底物复合物待酶分子与底物结合构象变化形成稳定复合物后，催化断键是瞬间发生。一般通过分子动力学/量子力学(MM/QM)，的方法进行研究。对外切纤维素酶CBHI的分子动力学模拟，CBHI的催化孔道与糖链之间有分子间氢键作用，糖分子所有的羟基与各种氨基酸残基相互作用，起到稳定酶-底物复合物的作用。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程474.6.2.2共价糖基-酶中间体的形成催化循环的第一步纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程4.6.2外切纤维素酶对底物分子的催化断键过程484.6.2.3异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程494.6.2.3异头碳的恢复纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程504.6.3外切纤维素酶催化降解结晶纤维素的分子内协同模型CBHI的两结构域(CD与CBM)作用的分子内协同模型。纤维素酶持续性降解结晶纤维素的动态催化过程内切酶外切酶CBM外切酶催化结构域514.6.4外切纤维素酶持续性催化过程动力从何而来分子动态学指出，大分子的动态行为与其功能密切相关。新的酶学研究认为酶分子执行功能时要完成一系列构象变化，在这个过程中酶分子整体结构“编码”了蛋白质分子的动态构象行为，为其提供“预先组织的环境”