基于标准汤剂的健脾活血解毒颗粒制备工艺与质量标准

正文健脾活血解毒颗粒的处方与分析1处方来源本处方来源于医院多年临床经验方，有益气健脾，利水渗湿，止血消瘀之功。用于治疗溃疡性结肠炎常见上述证候者。2处方组成与分析健脾活血解毒方（党参、白术、茯苓、扶芳藤、地榆等）由我校附院陈国忠教授根据多年临床经验总结所组成的中药复方制剂。方中党参、白术益气健脾，兼能养血，共为君药；茯苓、泽泻利水渗湿，配合白术增强利湿之功，茯苓兼可益脾和胃，辅助君药补益脾气，凤尾草、白花蛇舌草清热利湿、解毒消肿，共为臣药，扶芳藤、地榆止血消瘀，共为佐药；甘草为使药，调和诸药，全方共奏健脾益气、清热利湿解毒、止血化瘀之功效。临床实践中该方对缓解期溃疡性结肠炎显示了较好的治疗效果。3处方药材研究3.1党参党参CODONOPSISRADIX，别名上党人参、台党参、潞党参，主产于我国陕西、山西、甘肃等地，在东北、西北、华北地区均有分布，是多年生缠绕性草本植物，根可药用。2015版《中国药典》中定义党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula（Franch.）Nannf.素花党参C.p.Nannf.var.modestaNannf.L.T.Shen或川党参C.tangshenOliv.的干燥根[1]。党参性甘、平，归脾、肺经，有健脾益肺、养血生津之功，在我国有着悠久的应用，常用于治疗咳嗽虚喘、脾胃虚弱、食少便溏、心悸气短、脱肛等症。20世纪60年代以来，国内外学者对党参的化学成分展开了研究，从其中成功分离鉴定了很多成分，这些成分包括三萜类、糖类、炔类及聚炔类、生物碱类、甾体类等[2]。其中炔类成分中的党参炔苷、党参炔苷宁广泛分布于党参属植物中，糖类中的党参多糖是其糖类主要成分[3]。现代药理学研究表明，党参具有抗溃疡、调节肠胃机能、强心、抗休克、调节免疫功能、抗菌抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。党参多糖与调节免疫功能、抗肿瘤的药理作用具有相关性[4]。3.2白术白术ATRACTYLODISMACROCEPHALAERHIZOMA别名：山精、山姜、冬术，野生种近乎绝迹，目前在浙江、江苏、安徽、福建、湖北多地均有广泛栽培。为菊科植物白术AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根茎，白术苦、甘，温；归脾、胃经，具有补脾、益气、燥湿、安胎之功，常用于治疗脾虚食少、腹胀泄泻等。其化学成分以挥发油、多糖类、内酯类为主，此外还有少量氨基酸、维生素类成分，其中苍术酮为白术挥发油中的主要成分[5,6]。白术有着治疗胃肠道疾病、抗氧化、调节血脂、调节血糖、调节免疫功能、抗癌等多种药理作用。在治疗胃肠道疾病方面研究甚多，白术挥发油能够促进胃排空、肠推进发挥治疗作用，白术多糖对肠道益生菌的生长有促进作用，白术及其有效成分对于胃肠粘膜修复都有积极作用[7,8]。3.3茯苓茯苓PORIA别名茯灵、茯菟、白茯苓、云苓，主产于安徽、湖北、河南、云南，在福建、贵州、浙江、湖北、湖南、广东、广西、四川等多地均有分布。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，性甘、淡，平；入心、肺、脾、肾经，为利水渗湿的要药。具有利水渗湿，健脾和胃，宁心安神的功效，常用于治疗脾虚食少、便溏泄泻、心神不宁、水肿、小便不利，也可与多种中药配伍发挥独特的疗效，用途广泛。茯苓中的化学成分以多糖类、三萜类化合物为主，也包含少量甾体类、氨基酸类、胆碱类以及挥发油等成分[9]，其中多糖类成分占茯苓菌核干质量达70％～90％[10]。现代药理学研究表明，茯苓具有利尿、抗炎、调节胃肠功能、调节免疫功能等多种药理作用，茯苓多糖能增加机体免疫机能[11]。3.4扶芳藤扶芳藤Euonymusfortunei别名金线风、络石藤、爬墙草、换骨筋、小藤仲、爬行卫矛，以带叶茎枝入药，在我国广西、贵州、云南、浙江等地分布较多。扶芳藤学名：Euonymusfortunei(Turcz.)Hand.-Mazz，为卫矛科卫矛属常绿藤本灌木。其苦、甘、微辛，微温，归肝、脾、肾经，具有止血消瘀、通经、舒筋活络、益肾壮腰的功效，主要用于治疗跌打损伤、吐血、肾虚腰膝酸痛、腰肌劳损、有经不调、血崩等。扶芳藤始载于《本草拾遗》：“主一切血，一切气，一切冷，大主风血。以酒浸服。”作为广西常用特色民族药，在《广西药植名录》也有记载，广西著名中成药制剂“复方扶芳藤合剂”(原名百年乐)的重要组成之一就是扶芳藤。扶芳藤中含有较多的化学成分有黄酮类、三萜类、木脂素类成分，另外还有少量生物碱类、有机酸类成分[12]。现代药理学研究发现，扶芳藤具有镇痛抗炎、止血、抗心肌缺氧、改善认知障碍、调节免疫的药理作用[13-15]。其中，槲皮苷、山柰苷等黄酮苷类成分可能与扶芳藤在止血化瘀、调节免疫等药理作用具有相关性[16]。3.5地榆地榆SANGUISORBAERADIX又名黄瓜香、猪人参、血箭草，广泛分布于我国黑龙江、甘肃、湖南、河北、广西等多个省份，欧洲、亚洲北温带也又分布。2015版《中国药典》中定义蔷薇科植物地榆SanguisorbaofficinalisL.或长叶地榆SanguisorbaofficinalisL.var.longifolia（Bert.）YüetLi的干燥根。后者习称“绵地榆”。地榆性苦、酸、寒，入归肝、大肠经，有止血凉血、泻火解毒敛疮的功效，传统医家多用于治疗止脓血、乳痛带下、血痢、尿血等症。地榆中所含的活性成分众多，主要为鞣质、黄酮、三萜、三萜皂苷、鞣质、黄酮，其中鞣质成分尤为丰富[17,18]。随着现代医疗技术的发展，发现地榆具有止血、抗炎、抗菌、抗氧化、调节免疫等多种药理作用，在临床实践中用于治疗溃疡性结肠炎、直肠炎都取得了较好的疗效[19-21]。3.6泽兰泽兰HerbaLycopi别名地瓜儿苗、蛇王草、甘露秧、虎兰，全国各地均有分布，资源丰富，也有很多地方栽培泽兰，为唇形科植物毛叶地瓜儿苗LycopuslucidusTurcz.var.hirtusRegel的干燥地上部分。泽兰味苦、辛，性微温，入肝、脾经，有活血化瘀、行水消肿、调经、消痈的功效，常用于月经不调、经闭、痛经、产后瘀血腹痛、水肿的治疗。泽兰首载于《神农本草经》，古代医家应用甚多，在多本古代医学著作中都有记载。近年来，在泽兰中分离并鉴定出了数种类型化合物，其中有三萜类、酚酸类、黄酮类、甾体类和挥发油等多种化学成分[22,23]。多种化学成分的存在是泽兰丰富药理作用的基础，药理学研究显示，泽兰具有抗凝血功能、改善微循环、抗血栓、保护胃黏膜、抗癌、护肝等药理作用[24,25]。3.7泽泻泽泻ALISMATISRHIZOMA又名水泽、水泻、及泻、芒芋，主要栽培地区是福建、四川、江西，在黑龙江、辽宁、吉林、山东、浙江等多地也有分布，为泽泻科植物泽泻Alismaorientale（Sam.）Juzep.的干燥块茎。泽泻性味甘，寒，归肾、膀胱经，具有利水、渗湿、泄热通淋、化浊降脂的功效，常用于治疗小便不利、水肿胀满、泄泻尿少、痰饮眩晕、热淋涩痛、带下等症。泽泻首载于《神农本草经》，单方及其复方自古代起就多有应用，在加味地黄丸、泽泻丸、猪苓汤中都有应用泽泻。随着现代药理学、色谱技术等的发展，对泽泻中的化学成分的分离、鉴定以及药理作用研究取得了很多进展[26]。泽泻中的化学成分以三萜类化合物为主，此外还含有倍半萜、二萜、黄酮、多糖、生物碱以及一些包括钾、镁、钙在内的无机元素[27,28]。有着利尿、降压、调节血脂、对抗动脉粥样硬化、调节血糖、抗炎等多种药理作用[29-31]。3.8白花蛇舌草白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa又名蛇舌草、蛇舌癀、蛇脷草、蛇总管，国内外均有分布，在我国主要分布在长江以南的广西、广东、福建、海南、云南等地，为茜草科植物白花蛇舌草HedyotisdiffusaWilld.的全草，是一年生草本植物。白花蛇舌草性味苦、甘，寒，入胃、大肠、小肠经，具有清热解毒、活血散淤、利尿之效，临床常用于治疗肠痈、痢疾、肿瘤等症。白花蛇舌草是一种应用较多的传统中药、民族药，在苗族、壮族、傣族、侗族等少数民族中都有相关应用记载。白花蛇舌草含有蒽醌类、环烯醚萜苷类、黄酮类、三萜类、甾醇类、香豆素类、烷烃类等化学成分[32,33]。近年药理学研究显示，白花蛇舌草具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗菌等多种药理作用[34,35]。特别是抗癌方面，众多研究表明，白花蛇舌草对胃癌、肝癌、白血病、肺癌、乳腺癌等多种癌症有治疗作用，具有巨大的开发潜力[36,37]。3.9凤尾草凤尾草Pterismultifidapoir别名鸡脚草、井口边草、五指草，在我国西南地区有着丰富的资源分布，是凤尾蕨科(Pteridaceae)凤尾蕨属(Pteris)植物。凤尾草性淡、微苦、寒，归大肠、心、肝经。功效为清热利湿，凉血解毒，常用于治疗湿热痢、泄泻、湿疹、淋浊等方面。凤尾草中含有多种化学成分，主要有倍半萜、甾醇、二萜、香豆素类等成分，此外还含有少量的生物碱、黄酮类、挥发油类成分[41,42]。凤尾草是使用悠久的中草药，在近现代，通过药理研究表明，凤尾草多糖具有增强免疫力，降血脂，血糖，解毒，抗菌，抗辐射等作用[38-40]。3.10广木香木香AUCKLANDIAERADIX中国过去因多经广州进口，故有“广木香”之称。现主产于云南，故又称“云木香”，为菊科植物木香AucklandialappaDecne的干燥根。性辛、苦，温，归脾、胃、大肠、三焦、胆经。有行气止痛，健脾助消化的功效，多用于食积不消、泄泻腹痛。迄今为止从木香中提取得到的主要成分包括萜类、生物碱、蒽醌、黄酮类成分等[43,44]，其中木香烃内酯和去氢木香内酯为木香中的主要活性成分，其含量因产地的不同而存在一定差异，其成分含量占1.47%～2.13%[45]。2015版《中华人民共和国药典》中规定木香药材中木香烃内酯和去氢木香内酯总含量不得低于1.8%。古代医家常用木香配伍不同中药治疗腹痛、胃脘痛、泄泻、呃逆、呕吐等疾病。近年来国内外研究表明，木香不仅可用于腹痛、腹泻、食欲不振、消化不良、消化道溃疡等胃肠道疾病的治疗[46,47]，且可用于肿瘤、冠心病、急性胰腺炎、急性胆囊炎、肺感染等的治疗[48]。3.11炙甘草炙甘草GLYCYRRHIZAERADIXETRHIZOMAPRAEPARATACUMMELLE为甘草采用蜜炙法炮制的加工品，甘草RadixGlycyrrhizae又名甜草根、红甘草、国老，在亚洲、欧洲、美洲各个大陆都有分布，并且都有着久远的药用记载。为豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根和根状茎。炙甘草甘、平，入心、肺、脾、胃经，功在补脾和胃、祛痰镇咳、调和诸药，主要用于治疗脾胃虚弱、脘腹挛痛、倦怠乏力等症。甘草被称为“国老”，是我国重要的传统中药，在多种中药复方中常作为佐使药。炙甘草主要的化学成分有三萜皂苷、黄酮类、香豆素、多糖、生物碱、甾醇等[49,50]，现代药理学研究表明，其具有调节免疫、抗凝血、抗肿瘤、抗抑郁、抗菌等丰富的药理作用[51,52]。第二部分基于标准汤剂的健脾活血解毒方指纹图谱研究在新剂型的研发过程中，如何保证原方制剂与传统汤剂中所含物质的一致性[53]，是新制剂与传统汤剂在安全性和临床疗效上能够保持一致性的基础。健脾活血解毒方是我校附院临床用于治疗溃疡性结肠炎的临床经验方，疗效肯定。标准汤剂是在中医药理论指导下，按照临床汤剂煎煮流程的规范化操作，固液分离，经适当浓缩的方法干燥制得[54]。标准汤剂即满足临床治疗需要的汤剂标准[55]。本文将以标准汤剂为切入点，建立健脾活血解毒标准汤剂、提取液、成品颗粒的特征图谱，通过药材指纹图谱对其中的特征峰进行溯源研究，以获得专属、整体的化学特征综合信息。将提取所得水提液、成型所得成品的指纹图谱与标准汤剂图谱进行一致性比对，监测有效成分含量的变化，从而在整个制备工艺流程中尽可能保存原有汤剂发挥药效作用的物质基础，使制剂质量控制更加全面。1仪器与材料仪器实验仪器见下表。表2-1实验仪器信息表仪器名称型号厂家电热恒温水浴锅XMTD–7000北京市永光明医疗仪器有限公司高效液相色谱仪waters2695/2998沃特世（上海）有限公司分析天平Sartorius224-1CN德国赛多利斯集团循环水真空泵SHZ-Ⅲ上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发仪EYELAN–1100上海爱明仪器有限公司电子调温电热套98-1-B天津市泰斯特仪器有限公司台式高速冷冻离心机TGL-16M湖南湘仪实验室仪器开发有限公司1.2试剂表2-2试剂信息表名称批号厂家没食子酸对照品110831-201605中国食品药品检定研究院乙腈（色谱纯）18075006美国天地(TEDIA)试剂公司甲醇（色谱纯）18023008美国天地(TEDIA)试剂公司1.3药材药材信息见表。表2-3药材信息表名称产地/批号党参甘肃（18040785、180501、180516、20180313、181206、181122）山西（20180921、180621）陕西（180401、20180419）白术浙江（180513702、181201、1812001、20180601、190302004）安徽（180531、180701、20181201、181201571）湖南（181101）茯苓云南（180513604、180801141、20180201）安徽（181101、190301、180119、181001、190301）广西（1903003059）地榆湖南（180409301、170301）广西（170701、20181101、171101、180801）甘肃（170724、18071101、160927）江苏（180701）扶芳藤广西（1705324、180503、190216、1709651、180907、1805543）浙江（180304、1806429、1705324）云南（180302）泽泻福建（180701501、18081101）广西（180301）四川（190303、181001、20181101、20181001、181104、181201、20170401）泽兰河南（180409005、180524007、180419）福建（20180215、181021）安徽（180625、20180711）江苏（181126）山东（180919、190112）白花蛇舌草广西（17071909、180206314、171116209、180629、180613）云南（180325、170919）广东（180426）福建（181016、171211）凤尾草广西（20180822、20181109、180317、20181125、20180905、180106、180418、20180225、181211、180621）广木香云南（181101、171213、180704、20180619、20190923）广东（181006、20180511、181218、180307、20181113）炙甘草甘肃（180514002、180716、181103、180902136、190108、180504、180517）宁夏（180709、180902、20181211）注：党参均为党参（Codonopsispilosula）、地榆为地榆（Sanguisorbaofficinalis）。2方法与结果2.1色谱条件2.1.1梯度洗脱程序色谱柱：DiamonsilC18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL，梯度洗脱程序见表2-4。表2-4梯度洗脱程序时间(min)051020212848535863A%581215171822232520B%959288858382787775802.1.2流动相的选择本研究采用同一色谱柱按2.1.1梯度洗脱条件以甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸四种流动相对同一成品供试品溶液进行梯度洗脱，比较所得色谱图，筛选试验合适的流动相。结果见图2-1，发现甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸体系洗脱能力不足，图谱中呈现的色谱峰较少。乙腈-0.1%磷酸体系下梯度洗脱，色谱峰数量适中，能满足本实验建立指纹图谱的要求。图2-1由于疫情期间无法回校拷贝色谱图，待补。2.1.3检测波长本研究采用同一色谱柱按2.1.1梯度洗脱条件乙腈-0.1%磷酸为流动相对同一成品供试品溶液进行梯度洗脱，进行全波长扫描，比较了供试品在259、274、315、350nm波长下的色谱图，筛选试验合适的检测波长。结果见图2-2，发现供试品在315nm波长下，色谱峰分布均匀、峰高适中、面积合适，因此检测波长考虑设置为315nm。图2-2由于疫情期间无法回校拷贝色谱图，待补。2.2溶液的制备2.2.1对照品贮备液的配制精密称取没食子酸标准品10.02mg用超纯水溶解于100mL容量瓶中，定容后取溶液过微孔滤膜（0.45μm），冷藏备用。2.2.2标准汤剂供试品溶液的配制取十个不同批次不同产地的处方药材按处方量称取，加8倍水，充分润湿，放置浸泡30min，加热煮沸后煎煮30min，趁热3层纱布过滤，滤渣再加入6倍水煎煮20min，滤过，合并滤液并水浴浓缩至500mL[56]。取所得的标准煎液置于2mL离心管中，12000×g离心5min，取上清液过微孔滤膜（0.45μm），冷藏备用。2.2.3水提液、成品供试品溶液的配置取十个不同批次的处方药材按第二部分最佳提取工艺得到水提液浓缩至500mL。取浓缩液适量置于2mL离心管中，12000×g离心5min，取上清液过微孔滤膜（0.45μm），即得水提液供试品溶液。另取十个批次药材处方药材按第二部分制备工艺制得成品5g，加适当水溶解，同法离心后，取上清液过微孔滤膜（0.45μm），制得成品供试品溶液。冷藏备用。2.2.4单味药材供试品溶液的配制分别称取党参、白术、地榆等各味处方药材100g，同法制得各单味药材供试品溶液。冷藏备用。2.2.5阴性对照供试品溶液的配制分别依次取缺党参、白术、地榆等的阴性处方药材，同2.2.2制得阴性对照供试品溶液。冷藏备用。2.3方法学考察2.3.1精密度试验精密吸取同一健脾活血解毒标准汤剂供试品溶液（B1），按2.1项色谱条件连续进样6次，以没食子酸峰（2号峰）为参照，计算共有峰的相对保留时间的RSD。结果表明共有峰的相对保留时间、相对峰面积的RSD均小于3％，仪器精密度良好。表2-5精密度试验结果-相对保留时间峰号进样次数123456平均值RSD%10.8910.9060.8980.9010.9030.9130.9020.82%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%31.1751.1431.1831.1581.1721.1691.1671.21%41.2811.2761.2971.3011.3061.2901.2920.90%51.4581.4611.4591.4631.4651.4561.4600.23%61.6411.6381.6491.6361.6321.6531.6420.49%71.8121.8261.8291.8031.8211.8151.8180.53%82.2612.2672.2512.2632.2372.2132.2490.91%92.2912.2962.3042.3162.3212.3412.3120.80%102.6492.6512.6632.6732.6432.6592.6560.41%112.9512.9572.9762.9812.9612.9832.9680.46%123.2633.2813.2733.2613.2693.2983.2740.42%133.3623.3623.3633.3623.3623.2513.3441.36%143.6073.6113.6293.6383.6013.6133.6170.39%153.7833.7643.7763.7613.7353.7413.7600.50%164.0424.0534.0614.0564.0864.1034.0670.56%174.1094.1574.1374.1324.1684.1334.1390.50%184.5034.5764.5694.5164.5324.5714.5450.69%194.7964.8034.8424.7914.8294.8474.8180.51%205.1075.1985.1025.1075.1635.1545.1390.76%215.2515.2635.2315.2015.2325.2075.2310.46%225.7335.7325.7045.7415.7385.7435.7320.25%236.1486.1416.1726.1616.1836.1276.1550.34%246.6296.6516.6826.6336.6376.6836.6530.37%256.9826.9746.9987.0157.0217.0197.0020.29%267.2497.2037.2287.2197.2017.2367.2230.26%表2-6精密度试验结果-相对峰面积峰号进样次数123456平均值RSD%13.3973.3673.3823.3383.3723.3063.3600.98%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%30.1750.1850.1830.1790.1830.1810.1811.98%40.2670.2680.2680.2680.2670.2710.2680.55%50.2890.2890.2970.2890.2860.3000.2921.89%60.9450.9330.9320.9560.9440.9570.9451.14%70.1530.1560.1520.1590.1500.1540.1542.05%81.1221.1341.1351.1331.1251.1361.1310.52%90.6260.6100.6180.6180.6280.6170.6201.06%101.2351.2391.2341.2381.2171.2101.2290.99%110.3790.3860.3770.3810.3830.3770.3810.94%120.6890.7000.6920.6910.6850.6850.6900.81%130.4450.4460.4580.4570.4550.4580.4531.33%143.1883.1963.1643.2183.1633.1763.1840.66%150.5320.5370.5200.5390.5260.5390.5321.46%160.7530.7700.7700.7510.7630.7520.7601.18%170.7870.7650.7860.7650.7600.7690.7721.50%180.4120.4250.4170.4270.4270.4210.4221.44%190.4610.4780.4660.4770.4620.4820.4711.93%200.1720.1670.1710.1670.1670.1700.1691.35%210.2440.2360.2410.2370.2470.2440.2421.79%220.2270.2250.2370.2270.2260.2320.2292.01%230.9460.9700.9460.9630.9410.9610.9551.22%240.1320.1250.1290.1270.1260.1260.1282.03%250.1280.1310.1340.1320.1300.1310.1311.53%260.1830.1710.1720.1710.1800.1780.1762.95%2.3.2重复性试验平行称取同一批次本方药材6份，按2.2.2中操作制备标准汤剂供试品溶液，按2.1项色谱条件进样，以没食子酸峰（2号峰）为参照，计算共有峰的相对保留时间的RSD。结果表明共有峰的相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%，表明试验的重复性良好。表2-7重复性试验结果-相对保留时间峰号样品号123456平均值RSD%10.9100.9090.8930.9110.9060.9160.9080.86%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%31.1851.1691.1841.1811.1781.1631.1770.75%41.2901.2971.2931.3001.2731.2861.2900.75%51.4521.4561.4701.4641.4801.4561.4630.72%61.6201.6381.6491.6361.6321.6531.6380.73%71.8141.8261.8291.8031.8211.8151.8180.52%82.2502.2322.2632.2342.2692.2592.2510.68%92.3222.3142.3072.2872.2922.3232.3080.66%102.6542.6252.6192.6572.6452.6572.6430.64%112.9402.9612.9612.9422.9762.9572.9560.45%123.2673.2483.2453.2313.2703.2663.2550.48%133.3883.3783.3683.3713.3603.3903.3760.35%143.6033.6423.6603.6173.6353.6393.6330.55%153.7643.7073.7013.7503.7153.7483.7310.71%164.0354.0964.0404.0874.0964.0844.0730.69%174.1334.1444.1584.1704.1314.1614.1500.38%184.5384.5524.5124.5334.5134.5014.5250.43%194.7964.8034.8424.7914.8294.8474.8180.51%205.1075.1985.1025.1075.1635.1545.1390.76%215.2085.2565.2555.2635.2375.2665.2480.42%225.7365.7465.7205.7005.7675.7055.7290.45%236.1376.1676.1256.1786.1386.1786.1540.38%246.6616.6856.6466.6906.6486.6886.6700.31%256.9837.0136.9966.9917.0037.0127.0000.17%267.2217.2547.2647.2637.2147.2417.2430.30%表2-8重复性试验结果-相对峰面积峰号样品号123456平均值RSD%13.3163.3353.3123.3973.3413.3803.3471.03%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%30.1770.1820.1810.1850.1800.1860.1821.82%40.2610.2720.2750.2670.2690.2620.2682.06%50.2920.2990.2900.2920.2850.2880.2911.63%60.9480.9580.9630.9320.9450.9280.9461.46%70.1500.1540.1540.1590.1600.1510.1552.64%81.1401.1351.1301.1271.1381.1221.1320.61%90.6330.6120.6120.6320.6130.6230.6211.60%101.2301.2111.2241.2331.2261.2251.2250.62%110.3810.3800.3750.3880.3820.3750.3801.28%120.6920.6860.6970.6860.6880.6880.6900.62%130.4560.4460.4570.4460.4550.4500.4521.11%143.2103.1593.1733.2173.2333.1623.1920.99%150.5460.5460.5430.5370.5330.5210.5381.80%160.7750.7660.7610.7620.7710.7670.7670.69%170.7860.7810.7780.7690.7900.7690.7791.11%180.4140.4170.4110.4150.4150.4150.4150.48%190.4770.4750.4630.4820.4660.4810.4741.66%200.1680.1730.1680.1670.1720.1710.1701.46%210.2480.2350.2400.2370.2420.2440.2411.96%220.2330.2330.2380.2350.2330.2280.2331.40%230.9370.9660.9670.9440.9660.9480.9551.39%240.1270.1320.1310.1280.1330.1310.1301.79%250.1310.1280.1340.1280.1300.1290.1301.75%260.1750.1830.1830.1810.1730.1760.1792.45%2.3.3稳定性试验取同一供试品溶液分别在0、2、4、8、16、24小时按2.1项色谱条件进样10μL，以没食子酸峰（2号峰）为参照，计算共有峰的相对保留时的RSD。结果表明共有峰的相对保留时间、相对峰面积RSD均小于3%，表明供试品在24小时内保持稳定。表2-9稳定性试验结果-相对保留时间峰号进样时间/h02481624平均值RSD%10.9180.9120.8980.8940.8940.9130.9051.18%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%31.1641.1691.1701.1891.1841.1891.1780.94%41.2811.2741.2911.2951.2931.2881.2870.62%51.4531.4731.4801.4611.4611.4631.4650.66%61.6331.6381.6491.6361.6321.6531.6400.53%71.8281.8261.8291.8031.8211.8151.8200.55%82.2562.2602.2392.2332.2642.2422.2490.56%92.3282.3022.2932.3162.3402.2862.3110.90%102.6122.6322.6282.6162.6352.6262.6250.34%112.9602.9302.9852.9542.9342.9372.9500.71%123.2343.2613.2663.2553.2713.2373.2540.47%133.3553.3693.3703.3783.3413.3403.3590.48%143.6003.6273.5903.6473.6363.6043.6170.62%153.7063.7093.7073.7403.7043.7183.7140.37%164.0424.0934.0374.0314.0824.0554.0570.63%174.1204.1684.1844.1214.1624.1074.1440.76%184.5194.5034.5314.5704.5504.5004.5290.60%194.7964.8034.8424.7914.8294.8474.8180.51%205.1075.1985.1025.1075.1635.1545.1390.76%215.2705.2215.2245.2265.2025.2675.2350.52%225.7315.7405.7245.7685.7305.7535.7410.29%236.1756.1826.1666.1306.1366.1766.1610.36%246.6556.6926.6726.6316.6646.6706.6640.30%256.9957.0186.9986.9916.9837.0227.0010.22%267.1997.1537.1797.1547.1527.2757.1850.66%表2-10稳定性试验结果-相对保留时间峰号进样次数02481624平均值RSD%13.3513.3043.3353.3323.3583.3543.3390.60%2（S）1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00%30.1830.1760.1750.1840.1840.1780.1802.30%40.2630.2670.2630.2640.2750.2610.2661.90%50.2970.2920.2930.2850.2930.2920.2921.34%60.9480.9280.9470.9430.9610.9380.9441.17%70.1540.1590.1510.1550.1500.1570.1542.23%81.1351.1351.1311.1241.1281.1331.1310.38%90.6300.6330.6110.6340.6150.6260.6251.55%101.2321.2391.2381.2351.2261.2191.2320.63%110.3880.3860.3750.3780.3880.3790.3821.49%120.6960.6970.7000.6890.6910.6970.6950.60%130.4580.4450.4530.4550.4580.4510.4531.09%143.2003.2243.2193.1753.1653.1853.1950.75%150.5200.5270.5410.5420.5230.5300.5311.73%160.7680.7650.7700.7640.7760.7640.7680.61%170.7640.7830.7890.7690.7630.7650.7721.43%180.4100.4220.4110.4270.4100.4170.4161.72%190.4770.4840.4810.4600.4730.4850.4771.95%200.1640.1620.1630.1650.1720.1630.1652.22%210.2440.2380.2400.2390.2460.2460.2421.49%220.2370.2380.2260.2380.2320.2300.2342.13%230.9530.9390.9300.9550.9540.9470.9461.06%240.1320.1330.1310.1270.1300.1250.1302.37%250.1330.1320.1330.1350.1310.1340.1331.06%260.1730.1760.1730.1740.1760.1700.1741.30%2.4指纹图谱研究2.4.1参照峰的选择标准汤剂供试品色谱峰中，2号峰没食子酸的峰面积适中，分离度良好，可以作为参照峰。2.4.2指纹图谱的建立（1）标准汤剂指纹图谱的生成按2.1项色谱条件，分别取对照品溶液、标准汤剂供试品溶液（B1～B10）各10μL进样，记录色谱图。将标准汤剂供试品色谱图导入国家药典委员会颁发的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2012版）”进行数据匹配，以中位数法生成对照图谱，见图2-4。选择稳定性好、吸收强、特征明显的色谱峰作为共有峰。结合对照品图谱图2-3分析，可以辨认没食子酸的色谱峰为2号峰。把没食子酸峰屏蔽不参与积分，对其他25个共有峰进行多点校正，自动匹配，以10批标准汤剂的对照图谱作为参照，计算10批标准汤剂图谱的相似度，B1～B10指纹图谱与对照图谱比较相似度分别为0.954、0.968、0.994、0.995、0.992、0.978、0.995、0.967、0.975、0.976，均在0.95以上。结果说明不同产地的本方药材质量稳定，不同批次标准汤剂的成分基本一致，可以保证制剂药效稳定。图2-3标准汤剂对照图谱与没食子酸图谱图2-410批标准汤剂叠加指纹图谱（B1～B10）及对照指纹图谱（BR）水提液指纹图谱的生成按第二部分2.1项梯度洗脱条件，分别十批次水提液供试品溶液（S1～S10）各10μL进样，记录色谱图。同标准汤剂图谱处理方法生成水提液对照图谱，计算十批水提液相似度，S1～S10指纹图谱与对照图谱比较相似度分别为0.983、0.987、0.989、0.975、0.974、0.979、0.965、0.985、0.969、0.988，均在0.95以上。结果表明试验筛选的提取工艺，稳定可靠。图2-510批标准汤剂叠加指纹图谱（S1～S10）及对照指纹图谱（SR）成品指纹图谱的生成将成品供试品（C1～C10）溶液各10μL按2.1中梯度洗脱进行分析，同法生成成品对照图谱，十批颗粒C1～C10指纹图谱与对照图谱相似度分别为0.987、0.988、0.975、0.979、0.986、0.964、0.975、0.969、0.983、0.988，均大于0.95。由此可见，研究得到的成型工艺简单可行稳定。图2-610批成品叠加指纹图谱（C1～C10）及对照指纹图谱（CR）2.4.3标准汤剂、水提液、成品图谱相关性分析（1）水提液与标准汤剂对照图谱比较分析将2.4.2中生成的水提液对照图谱（SR）与标准汤剂对照图谱（BR）进行比对分析，结果如图2-7。从图谱上可见，标准汤剂对照图谱中的特征峰基本能够在水提液对照图谱中找到对应的峰，表明试验优选的提取工艺可靠，能够较好保存标准汤剂发挥药效的相关物质基础。图2-7水提液对照图谱（SR）与标准汤剂对照图谱（BR）比较（2）成品与标准汤剂对照图谱比较分析将成品对照图谱（CR）与标准汤剂对照图谱（BR）进行比对分析，结果如图2-8。从图谱上可见，标准汤剂对照图谱中的特征峰基本能够在成品对照图谱中找到对应的峰，由此可见，研究得到的成型工艺能够较好保存标准汤剂中发挥药效的物质基础。图2-8成品对照图谱（CR）与标准汤剂对照图谱（BR）比较（3）标准汤剂、水提液、成品指纹图谱相似度分析将标准汤剂（B5、B6）、水提液（S5、S6）、成品颗粒（C5、C6）各两批的指纹图谱导入指纹图谱分析软件中，计算相似度。图2-9中标准汤剂、水提液、颗粒指纹图谱共标定了26个共有峰。由表2-11可见，健脾活血解毒颗粒的标准汤剂－水提液－颗粒三者之间图谱相似度高，表明三者化学成分相似，有着相似的物质基础，试验筛选的制备工艺稳定可靠，可以用于产品质量的辅助评价。图2-9标准汤剂、水提液、颗粒指纹图谱对比图表2-11标准汤剂、水提液、颗粒指纹图谱相似度B5B6S5S6C5C6对照指纹图谱B510.9620.9380.9340.9110.9340.969B60.96210.9760.9690.940.9780.989S50.9380.97610.9860.9610.9850.989S60.9340.9690.98610.9710.9790.988C50.9110.940.9610.97110.9530.973C60.9340.9780.9850.9790.95310.986对照指纹图谱0.9690.9890.9890.9880.9730.98612.4.4没食子酸转移率将制备好的十个批次的健脾活血解毒水提液、成品按2.2中操作方法制备供试品溶液后，各取10μL注入高效液相色谱仪，照2015版《中国药典》地榆项下没食子酸含量测定方法测定其中没食子酸含量，计算水提液、成品中没食子酸总量[57]。将标准汤剂、水提液、成品中没食子酸含量进行比较。结果可知，研究优选的提取工艺能够很好的提取健脾活血解毒方中的有效成分没食子酸，且较传统工艺提取效率更高。没食子酸转移率为80.66%，本研究优选的制备工艺能够很好地保留原方药材中有含量指标成分没食子酸，工艺简单稳定，为后续药效学研究奠定了理论基础。表2-12标准汤剂、水提液、颗粒中没食子酸含量变化没食子酸含量（mg）没食子酸含量（mg）没食子酸含量（mg）转移率（%）标准汤剂1106.48水提液1115.61成品193.2280.63%标准汤剂2104.28水提液2116.93成品294.5680.87%标准汤剂3106.23水提液3116.16成品395.0181.79%标准汤剂4105.89水提液4117.26成品493.6979.90%标准汤剂5106.37水提液5117.81成品594.3180.05%标准汤剂6104.88水提液6116.28成品694.6781.42%标准汤剂7104.61水提液7115.94成品795.1882.09%标准汤剂8105.69水提液8117.31成品894.2880.37%标准汤剂9104.21水提液9116.85成品993.0579.63%标准汤剂10107.23水提液10117.53成品1093.8179.82%平均值105.59平均值116.77平均值94.1880.66%2.4.5颗粒指纹图谱峰归属按2.1项梯度洗脱色谱条件，分别取单味药材供试品溶液和阴性对照供试品溶液各10μL进样，记录色谱图。将单味药材图谱、阴性对照图谱、标准汤剂对照图谱、水提液对照图谱、颗粒对照图谱进行叠图比对，分析26个共有峰的来源和归属。其中2号来源于地榆，7号峰来源于泽泻，26号峰来源于扶芳藤，19、23号峰来源于泽兰，13、14、15、21号峰来源于白花蛇舌草，6、11、12、18号峰源自凤尾草，5号峰来源于木香，16、17、24、25号峰来源于甘草。其余共有峰不能在药材中找到归属，可能是药材在煎煮提取过程发生相互作用生成了新的化学成分。党参的峰不能在图谱中找到归属，与党参薄层色谱中结果一致。茯苓以多糖成分为主，该检测方法无法检测出相关峰，因此也没有找到相关的峰归属于茯苓。白术的峰也无法找到相应归属，可能是其中成分在制备过程中产生了变化。aabbccd图2-10健脾活血解毒颗粒指纹图谱峰归属d注：a、b、c、d为各单味药材与相应阴性药材、成品颗粒、水提液、标准汤剂对照图谱的叠图3讨论3.1色谱条件的选择本实验应用了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.05%磷酸四种流动相对成品颗粒供试品进行梯度洗脱，进行全波长扫描。结果发现甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.05%磷酸、乙腈-0.05%磷酸体系洗脱能力不足，图谱中呈现的色谱峰较少。乙腈-0.1%磷酸体系下梯度洗脱，色谱峰数量适中，能满足本实验建立指纹图谱的要求。乙腈-0.1%磷酸流动相按照对成品颗粒供试品进行梯度洗脱，进行全波长扫描。发现供试品在315nm波长下，色谱峰分布均匀、峰高适中、面积合适，因此检测波长考虑设置为315nm。3.2标准汤剂的意义在传统中药的制剂生产过程中，标准汤剂可以作为其制剂工艺筛选、优化及质量标准制定的基准和依据，从而保证制剂临床疗效与传统汤剂的一致性，同时不增加其毒性。本研究将健脾活血解毒方标准汤剂作为物质基准，与水提液、成品的对照图谱进行比较，证明了试验筛选的制备工艺制备的水提液、成品与临床用汤剂具备同样的物质基础，也为全面控制健脾活血解毒颗粒的质量提供了参考。4结论本实验采用十个批次不同产地的药材所制备的健脾活血解毒标准汤剂、水提液、成品质量稳定，三者指纹图谱与其相应的对照图谱相似均大于0.95。标准汤剂图谱中的共有峰能在水提液、成品图谱中对应位置找到，三者图谱相似度高且没食子酸转移率高，试验优选的制备工艺能够很好的提取和保留方中有效成分没食子酸。其中18个共有峰能归属到处方药材。制备工艺所得水提液、成品与临床用汤剂在物质基础上具有一致性。第三部分健脾活血解毒颗粒的制备工艺实验研究1仪器与试药2.1仪器实验仪器见表3-1。表3-1实验仪器信息表仪器名称型号厂家超微粉碎机FS3OC广州雷迈机械设备有限公司电热恒温干燥箱DHC-924OA上海精宏实验设备有限公司全波长多功能酶标仪InfiniteM200PRO帝肯（上海）贸易公司注：其余仪器同第二部分。2.2试剂实验试剂见表3-2。表3-2试剂信息表名称批号厂家没食子酸对照品110831-201605中国食品药品检定研究院D-无水葡萄糖110833-201707中国食品药品检定研究院芦丁对照品MUST-17111601中国食品药品检定研究院甲醇（色谱纯）18023008美国天地(TEDIA)试剂公司盐酸20180221廉江市爱廉化试剂有限公司苯酚20180102廉江市爱廉化试剂有限公司亚硝酸钠20170612成都金山化学试剂有限公司氢氧化钠20190401天津市大茂化学试剂厂硝酸铝20180514天津市科密欧化学试剂有限公司浓硫酸20171217廉江市爱廉化试剂有限公司没食子酸对照品110831-201605中国食品药品检定研究院糊精（药用级）180306陕西秦发糊精有限责任公司可溶性淀粉（药用级）02018017贵州欣紫鸿药用辅料有限公司蔗糖20180625河南恒锐食品添加剂有限公司2.3药材药材信息见表3-3。表3-3药材信息表名称基源批号厂家党参党参Codonopsispilosula18040785广西万宝堂药业有限公司白术白术Atractylodesmacrocephala180513702广西万宝堂药业有限公司茯苓茯苓Poriacocos180513604广西万宝堂药业有限公司扶芳藤扶芳藤Euonymusfortunei1705324广西万宝堂药业有限公司地榆地榆Sanguisorbaofficinalis180409301广西万宝堂药业有限公司泽泻泽泻Alismaorientale180701501广西万宝堂药业有限公司炙甘草甘草Glycyrrhizauralensis蜜炙法加工品180514002广西万宝堂药业有限公司白花蛇舌草白花蛇舌草Hedyotisdiffusa1707190广西万宝堂药业有限公司泽兰地瓜儿苗Lycopuslucidus180409005广西万宝堂药业有限公司凤尾草木香凤尾草Pterismultifida2018082220180813广西万宝堂药业有限公司广西万宝堂药业有限公司木香Aucklandialappa通过广西中医药大学药学院韦松基教授鉴定检验，均符合2015版《中华人民共和国药典》一部各味药材项下的相关规定。其中，地榆中没食子酸测定结果为12.5mg/g。2提取工艺的研究健脾活血解毒颗粒由11味中药组成，通过对处方中各味中药的理化性质、药理作用、临床疗效查阅相关文献以及前期预实验，采用了单因素、正交试验法，以干膏得率、总多糖、总黄酮、没食子酸含量多种指标综合评价的方法筛选最佳提取工艺，确定最佳的提取工艺路线。临床用法为水煎，故采取的评价指标以水溶性成分为主，同时兼顾部分脂溶性成分（如白术、木香的挥发油），党参中的党参炔苷、地榆中的没食子酸等有效成分都属于水溶性成分，同时本方也含有较多的多糖类、黄酮类成分，都在水中有着较好的溶解度，因此在提取工艺部分选择提取溶剂为水[58]。既可以较好的提取有效成分，也在一定程度上降低了成本，同时也与临床上本方加适量水煎煮后服用的用药方法保持了一致性。此外，本方中白术、木香两味药材中虽含有挥发油成分，但预实验中采取索氏提取器回流提取收集到的挥发油量少于0.5mL，因此实验直接采用水煎煮提取，采用索氏提取器回收挥发油，冷藏待成型工艺喷入制粒。2.1考察指标的评价2.1.1干膏得率的计算取健脾活血解毒方水提液过滤后弃去药渣，将滤液浓缩至200mL，放置冷却，精密量取浓缩液20mL，置于已干燥至恒重（连续两次称量所得质量之差<0.3mg）的蒸发皿中，置于恒温水浴锅中水浴2.5h蒸干，待蒸干后置于105℃烘箱干燥6h，快速置于干燥器中冷却半小时，称重，按公式计算干膏得率[59]，平行实验两次。干膏得率%=浓缩液体积（mL）×干膏质量（g）取样量（mL）×投药量（g）2.1.2没食子酸测定照2015版《中国药典》地榆项下没食子酸含量测定方法[57]。（1）色谱条件色谱柱为DiamonsilC18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇－0.05%磷酸(5∶95)；流速：1.0mL/min；检测波长：272nm；进样量：10μL；理论塔板数以没食子酸计不低于2000。（2）供试品溶液的配置取浓缩液10mL，置于圆底烧瓶中，加入10%盐酸溶液40mL，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100mL容量瓶中，用水适量分数次洗涤容器和残渣，洗液滤入同一容量瓶中，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）过滤，取续滤液，即得。（3）对照品溶液的配置精密称取没食子酸标准品10.02mg用超纯水溶解于100mL容量瓶中，过微孔滤膜(0.45μm)，冷藏备用。（4）阴性对照溶液的配置按处方比例称取分别除地榆以外的其他药材，与供试品溶液相同方法制得相对应的阴性样品液。（5）专属性试验分别吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品液各10μL注入高效液相色谱仪，按2.1.2项条件进行测定。1a1ab1b1cc图3-1健脾活血解水提液没食子酸的含量测定专属性试验HPLC图谱注：a.没食子酸对照品；b.供试品；c.阴性样品；1.没食子酸色谱峰（6）标准曲线的制备与线性关系的考察分别精密吸取浓度为100.2μg/mL的没食子酸对照品溶液0.5mL、2mL、4mL、6mL、8mL至10mL的容量瓶中加纯水定容至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜(PTFE)过滤，加入进样瓶。分别取10uL注入液相色谱仪，按2.1.2项条件进行测定，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得出线性回归方程：y=35130x-13229，相关系数r=0.9996。结果表明没食子酸在5.1～81.6μg/mL范围内呈现良好线性关系。对照品浓度（μg/mL）图3-2没食子酸标准曲线2.1.3总多糖的测定采用紫外分光光度计测定水提液中多糖含量，测定方法为“苯酚硫酸法”。将待测液放入10mL试管中，加入1mL5%苯酚溶液，摇匀，加浓硫酸5mL，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸，混匀后置于沸水中加热15min，取出，立即置于冷水中冷却10min[60]。用移液枪吸取对照品溶液于光吸收微孔板，以试剂为空白，在波长490nm处测定其吸光值。对照品贮备液的制备精密称取2.50mgD-无水葡萄糖标准品粉末置于25mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，超声30min溶解，得浓度为0.1mg/mL的对照品溶液。供试品溶液的制备将健脾活血解毒水提液过滤后，取滤液加热浓缩至200mL，放冷。精密量取1mL浓缩液用超纯水定容至50mL。精密量取稀释后溶液1mL再用超纯水稀释定容至50mL，最终所得液体即供试品溶液。阴性对照溶液的制备本方提取溶剂为水，因此将纯水作为阴性对照溶液。（4）标准曲线的绘制精密移取0.1mg/mL葡萄糖对照品溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL、4.5mL、5mL分别置于5mL容量瓶中，加纯水定容至刻度。取各浓度的标准溶液1mL分别置于10mL试管中按2.1.3中“苯酚硫酸法”操作，以浓度C（mg/mL）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，进行回归计算[61]，得回归线性方程。A=5.9142C+0.1299，相关系数r=0.9993，葡萄糖在0.01～0.10mg/mL范围内呈现良好线性关系，葡萄糖标准曲线表见表3-4，图见图3-3。表3-4葡萄糖标准曲线及线性关系表浓度C(mg/mL)0.010.020.030.040.050.060.070.080.090.1吸光度A0.18550.25020.31060.36080.42880.48630.54830.59630.66860.7568图3-3葡萄糖标准曲线图2.1.4总黄酮的测定水提液中总黄酮的含量测定采用紫外分光光度计测定。将待测液置于试管中，加1mL5%亚硝酸钠溶液摇匀，静置6min，加入1mL10%硫酸铝溶液，摇匀，静置6min，再加入4mL1mol/L氢氧化钠溶液，在500nm波长处测定吸收度。对照品贮备液的制备精密称取芦丁对照品20.02mg，加入70%乙醇溶解并定容至50mL，超声30min使芦丁溶解，得浓度为400.4μg/mL的芦丁对照品溶液，冷藏备用。（2）供试品溶液的制备将健脾活血解毒水提液过滤后，取滤液加热浓缩至200mL，放冷。精密吸取浓缩液1mL，加纯水稀释至15mL，即得供试品溶液。（3）阴性对照溶液的制备本方提取溶剂为水，因此将纯水作为阴性对照溶液。（4）标准曲线的绘制精密量取浓度为400.4μg/mL的芦丁对照品溶液0.5mL、1mL、1.5mL、2mL、2.5mL、3mL、3.5mL、4mL，分别置于5mL容量瓶中，加70%乙醇定容至刻度。取各浓度溶液1mL按2.1.4测定方法测定吸光度，分别以浓度C为（mg/mL）为横坐标，以吸光度（A）为纵坐标，进行回归计算，得回归线性方程。A=2.1954C+0.1484，相关系数r=0.9993，表明芦丁在0.04～0.32mg/mL范围内呈现良好线性关系，芦丁标准曲线表见表3-5，图见图3-4。表3-5芦丁标准曲线及线性关系表浓度C(mg/mL)0.040.080.120.160.200.240.280.32吸光度A0.23020.32070.41330.50750.59230.68010.76100.8431图3-4芦丁标准曲线图2.2方法与结果2.2.1提取工艺单因素考察通过查阅文献，本文以干膏得率、没食子酸含量、总多糖、总黄酮为考察指标，以粉碎度、浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为考察因素进行单因素试验考察，确定每个因素的主要水平[62～64]。根据各单因素实验考察结果选取具有考察研究意义的单因素，采用L9（34）正交试验设计法对水提工艺进行优选。药材粉碎度的选择及结果将药材分别粉碎为饮片、最粗粉、粗粉、中粉四种（其中饮片不需粉碎），考察粉碎度对水提液的干膏得率、没食子酸含量、总多糖、总黄酮四个指标的影响。分别按处方量称取饮片、最粗粉、粗粉、中粉的处方药材共四份，以14倍水量提取1次，每次2小时。四份提取液按2.1.1、2.1.2、2.1.3、2.1.4项下方法测定干膏得率、没食子酸含量、总多糖、总黄酮含量，按均一法计算综合得分。结果见表3-6，因此单因素试验中药材的最佳粉碎度应选择粗粉。表3-6不同药材粉碎度的测定结果药材粉碎度得膏率（%）均一值总黄酮（%）均一值总多糖（%）均一值没食子酸（%）均一值综合得分饮片23.5416.11024.9600.057401最粗粉16.4909.820.46033.510.069540.7312.191粗粉20.650.59014.18131.50.7660.07413.356中粉21.870.76410.380.52925.60.0750.06150.2471.615（2）药材浸泡时间的选择及结果根据药材粉碎度试验可知粗粉为最佳选择，分别按处方量称取处方药材粗粉共五份，分别浸泡0h、0.5h、1h、1.5h、2h，以14倍水量提取1次，每次2小时。五份提取液测定干膏得率、没食子酸含量、总多糖含量、总黄酮含量，按均一法计算综合得分，结果见表3-7。可知：单因素试验中最佳药材浸泡时间为0小时，无须浸泡即可直接提取。表3-7不同药材泡时间的测定结果浸泡时间得膏率（%）均一值总黄酮（%）均一值总多糖（%）均一值没食子酸（%）均一值综合得分0h17.15111.94130.540.8980.05460.0612.9590.5h13.28010.330.48129.410.7890.053701.2701h15.750.6389.410.18421.200.06090.4861.3092h14.80.3939.480.20627.040.5620.068512.1613h16.050.7168.84031.610.06480.752.466（3）加水倍数的选择及结果在（1）、（2）试验结果基础上，进行提取工艺加水倍数的考察。分别按处方量称取处方药材粗粉共五份，分别加入8倍、10倍、12倍、16倍、20倍水量，提取1次，每次2小时。提取液分别测定干膏得率、没食子酸含量、总多糖含量、总黄酮含量，按均一法计算综合得分，结果见表3-8。结果表明，单因素试验中的最优加水量为12倍水量。表3-8不同药材加水倍数的测定结果加水倍数得膏率（%）均一值总黄酮（%）均一值总多糖（%）均一值没食子酸（%）均一值综合得分8倍16.9407.7016.7200.03720010倍19.530.2388.40.10623.410.8830.04840.5541.78112倍230.55812.410.71120.210.460.05620.9412.67116倍210.37414.32124.310.05670.9653.33920倍27.8111.250.53621.960.6910.057413.228（4）提取时间的选择与结果根据预实验，确定了药材提取时间的平衡点及范围。在（1）、（2）、（3）试验结果基础上，进行提取时间的考察。分别按处方量称取处方药材粗粉共五份，浸泡0h，加入12倍水量，提取1次，分别提取0.5h、1h、1.5h、2h、3h、5h。提取液分别测定干膏得率、没食子酸含量、总多糖含量、总黄酮含量，按均一法计算综合得分，结果见表3-9。可知：单因素试验中最佳提取时间为1h。表3-9不同药材提取时间的测定结果提取时间干膏得率（%）均一值总黄酮（%）均一值总多糖（%）均一值没食子酸（%）均一值综合得分0.5h19.130.0418.03013.7800.06770.5960.6371h21.690.39413.69124.7510.076813.3941.5h18.83010.790.48723.250.8630.06930.6672.0182h25.050.85711.400.59523.50.8860.054302.3393h26.08112.690.82324.070.9380.06140.3163.077（5）药材提取次数的选择与结果在上述试验结果基础上，进行药材提取次数的考察。分别按处方量称取处方药材粗粉共三份，浸泡0h，加入12倍水量，提取1、2、3次，每次1h。提取液分别测定干膏得率、没食子酸含量、总多糖含量、总黄酮含量，按均一法计算综合得分，结果见表3-14。结果表明，提取2次为单因素试验中的最优提取次数。表3-10不同药材提取次数的测定结果提取次数干膏得率（%）均一值总黄酮（%）均一值总多糖（%）均一值没食子酸（%）均一值综合得分提1次21.08014.19023.700.067700提2次27.12117.94135.020.8600.11120.8033.663提3次25.930.80316.280.55736.8710.121913.3572.2.2正交实验优选提取方法及结果通过单因素考察5个指标，其中浸泡时间对各参数无影响，故采用正交实验对剩余的4个指标进行优化，采用L9（34）正交试验设计法对水提工艺进行优选，四个因素分别是：A（粉碎度）、B（加水倍数）、C（提取时间）、D（提取次数）。结合单因素试验结果以及生产能耗、成本等实际情况将因素水平设置如下表3-11。表3-11因素水平表水平因素粉碎度（A)加水倍数（B）提取时间（C)提取次数（D)1饮片80.512粗粉12123中粉1623按处方量称取处方药材共18份，按照表因素水平设置进行提取，提取液趁热过滤，测定滤液的干膏得率、没食子酸含量、总多糖含量、总黄酮含量，采用将数值均一化后计算综合得分分析实验结果。考虑到单因素实验考查时，干膏得率测定结果并无明显差异，不宜作为评价指标，因此不纳入综合评分计算，综合评分＝=1\*GB3①没食子酸含量均一值+=2\*GB3②总多糖均一值+=3\*GB3③总黄酮均一值。正交实验结果见表3-12，方差分析表见表3-13。上述所考察实验因素对四个指标影响大小依次为：加水倍数＞提取次数＞提取时间＞粉碎度；方差分析表明：药材加水倍数以及提取次数对各项指标有显著性影响，综合各方面考虑各K值考虑药材粉碎较为耗时、实际生产的条件等原因故选择药材饮片，优选最佳提取工艺为A1B3C3D3，即选用党参等11味药材饮片，加16倍水提取3次，每次2h。表3-12正交实验表试验号ABCD总黄酮（%）/均一值总多糖（%）/均一值没食子酸（%）/均一值综合评分111119.65/013.27/00.0198/002122217.04/0.44121.98/0.4250.0678/0.5581.4243133326.41/133.75/10.1058/134212310.71/0.06324.65/0.5560.0751/0.6431.2625223115.42/0.34425.46/0.5600.0593/0.4591.3996231217.77/0.48433.29/0.9780.0561/0.4221.8847313217.75/0.48321.94/0.4230.0562/0.4231.3308321319.03/0.56030.78/0.8550.0939/0.8622.2769332117.78/0.48524.42/0.5440.0518/0.3721.402K11.47560.8641.3870.934K21.5151.7001.3631.546K31.66932.0951.9102.179R0.1941.2310.5471.245注：①没食子酸含量均一值、②总多糖均一值、③总黄酮均一值，综合评分＝①+②+③表3-13方差分析表因素偏差平方和自由度FF值R临界值P值粉碎度0.06321.00019.000加水倍数2.371237.63519.000*提取时间0.57328.93819.000提取次数2.328236.95219.000*误差0.062注：*为P＜0.05。2.2.3验证实验根据最佳提取工艺A1B3C3D3，取同一批药材，进行三批的验证试验。结果见表3-14。实验结果表明筛选的最佳提取工艺稳定可行。表3-14验证实验结果总黄酮（%）总多糖（%）没食子酸（%）验证125.8238.360.1068验证224.3836.260.1082验证323.7437.840.1052平均值24.6537.490.1067标准差0.870.890.003成型工艺研究3.1制备方法的选择目前健脾活血解毒方临床常用方法为自行煎煮后口服，而中药煎剂存在煎煮所需时长，易霉变，携带不便等缺点，且患者一次服用剂量大，口感和气味较差，患者顺应性差，而中药颗粒剂保存了原有煎剂的有效成分的前提下，具有服用方便，携带贮藏运输方便等优点，将健脾活血解毒方煎剂制成颗粒剂是可行的。干法制粒和湿法制粒是目前主流的制粒方法。干法制粒因为其生产设备要求高，对辅料性能也有一定的要求，所以大生产中应用并不多[65]。而湿法制粒所得颗粒有着外型美观、流动性好的优点，本方水提液热敏性成分较少，故采用湿法制粒，工艺为：挤压制粒法。操作流程：将处方药材用最佳提取工艺提取后，滤过，所得滤液合并后混合均匀，静置12小时。取上清液过9号筛（200目），滤去不溶性物质，所得滤液浓缩后得到的浸膏与辅料进行充分混合制软材。软材的理想效果为：握之成团，轻触即散，将软材强行挤压筛网后喷入提取工艺中收集的挥发油，整粒后制得颗粒。3.2处方量的确定浓缩是中药制剂原料成型前处理的重要单元操作。常压浓缩和减压浓缩是目前工业大生产中应用的最多的浓缩方法，常压干燥较减压干燥具有操作简便、设备要求简单的优点[66]。根据预实验可知，本方中