(4.5)-第三章酶的提取与分离纯化

酶的分离工程

将酶从生物细胞或培养物等含酶原料中提取出来，再与杂质分开，从而获得能够满足使用需求的一定纯度的酶的过程。

预处理（pretreatment）：包括发酵液性质改变和固液分离等。

酶的提取（extraction）：酶充分转入溶剂的过程。

粗分级分离（roughfractionation）：除去与目的产物性质差异较大的杂质。

细分级分离（finefractionation）：除去与产物性质相似的杂质。

浓缩、干燥与结晶（concentration,desiccationandcrystalization）（成品加工）:使酶与溶剂分离的过程。

第三章酶的提取与分离纯化本章内容

发酵液的预处理

酶的提取

酶的分离纯化

成品加工

酶分离纯化方案的设计与评价第一节发酵液的预处理发酵液的成分：细胞个体及碎片未利用的培养基细胞代谢产物预处理的目的：改变发酵液的物理性质除去部分杂质黏度高，杂质多，酶含量低且不稳定一、发酵液的预处理1.影响发酵液固液分离的因素（过滤为主）

细胞类型

发酵液的黏度二、发酵液的固液分离二、发酵液的固液分离2.固液分离的目的胞外酶：除去固体杂质和细胞，收集水相胞内酶：除去水相，收集细胞3.固液分离的常用方法过滤离心膜分离一、细胞破碎二、酶的提取第二节酶的提取（一）细胞壁及细胞膜组成

细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖（N-乙酰葡糖胺，N-乙酰胞壁酸）、脂质酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质霉菌：多糖（几丁质和葡聚糖）植物细胞：纤维素和果胶

动物细胞：细胞膜（磷脂双分子层）一、细胞破碎（胞内酶）

机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法微波破碎法

可联用

（二）细胞破碎的方法1.机械破碎法

匀浆法捣碎法研磨法（二）细胞破碎的方法2.物理破碎法超声波法压力差法

渗透压变化法高压冲击法突然降压法温度差法：反复低温冰冻，室温融化。（二）细胞破碎的方法————————————————————细胞超声机械渗透压温度————————————————————动植物++++++++++++革兰氏阴性菌++++++++革兰氏阳性芽孢菌++++++酵母++++革兰氏阳性球菌+-++菌丝-++-++孢子----细胞对破碎方法的敏感性3.化学破碎法应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变或破坏。

有机溶剂：破坏磷脂结构，常用丙酮、丁醇、氯仿等。

表面活性剂：与磷脂和脂蛋白作用，常用非离子型表面活性剂，如TritonX-100，Tween等。（二）细胞破碎的方法低温下，防止变性！4.酶促破碎法

自溶法：细胞结构在本身具有的各种水解酶作用下发生溶解的现象。

外加酶法：根据细胞壁的结构和组成特点，选用适当的酶。如何根据细胞壁特点选择酶？？（二）细胞破碎的方法

例：细菌细胞壁的结构

破壁时需加EDTA溶菌酶1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。（三）细胞破碎确认小结：细胞破壁方法及原理

酶的抽提：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶入溶剂的过程。

目标：将目的酶最大限度地溶解出来；保持生物活性。

注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温（0~10℃）操作。

原则：相似相溶；远离等电点的pH值二、酶的提取（extraction）（1）盐溶液提取法（盐溶，saltingin）常用低浓度盐溶液（0.02-0.5mol/L，常用NaCl、磷酸盐等），对酶稳定性好、溶解度大。1.提取方法1.提取方法（2）酸、碱溶液提取法在酸（pH2-6）、碱（pH8-12）溶液中溶解度大、稳定性好的酶（3）有机溶剂提取法与脂质结合或含有较多非极性基团的酶有机溶剂（与水互溶）：低级醇、丙酮、苯酚2.影响提取的主要因素（1）温度温度升高，酶的溶解度增加，溶解速率加快温度过高，酶易变性失活

低温提取：一般0-10摄氏度（2）pH

远离等电点，防止酶沉淀

不宜过高过低，防止变性失活（3）提取液体积

原料体积的3-5倍为宜，不宜过多其他因素：搅拌、时间、保护剂等小结：酶的提取方法第三节

酶的分离纯化一、沉淀分离二、离心分离三、过滤与膜分离四、层析分离五、电泳技术一、沉淀分离（根据溶解度的不同）

初步分离：使酶（或杂质）由液相转变为固相析出

常用方法盐析法有机溶剂沉淀法选择性变性沉淀法（热变性和酸碱变性）等电点沉淀法其他沉淀法（一）盐析沉淀法1.盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。稳定因素：水化膜、表面电荷常用：硫酸盐、氯化钠、磷酸盐等

盐浓度的调整（以硫酸铵为例）①

饱和溶液法：滴加饱和硫酸铵溶液②固体盐添加法：添加硫酸铵固体注意：盐析得到的沉淀再溶解后应用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。1.盐析过程分段盐析：不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出。1.盐析过程2.盐析的影响因素

S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）

S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks代表盐析效率，表示随着盐浓度的增加蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。①离子强度②蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。③

pH值：

等电点处最易沉淀。④温度：一般可在室温下进行，某些对温度敏感的酶可在低温下操作。2.盐析的影响因素利用酶与杂质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1.沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2.常用有机溶剂（与水互溶）丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右。

（二）有机溶剂沉淀法3.作用特点：优点：分辨率比盐析法高沉淀不需脱盐溶剂易挥发，沉淀易分离缺点：容易引起蛋白质变性失活，必须低温操作，沉淀后立即用水或缓冲液溶解有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

（二）有机溶剂沉淀法4.影响因素①温度低温，有机溶剂预冷②pH等电点附近③蛋白质浓度1.原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点

2.使用方法边滴加边搅拌，防止局部过酸过碱引起酶分子变性（三）等电点沉淀法单独使用等电点沉淀法能否使目的蛋白从反应体系中完全沉淀出来？可以不可以AB提交单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白）多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。单选题1分选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。1.热变性（耐高温酶）加热使改变蛋白结构，破坏水化层，使杂蛋白变性沉淀而保留目的酶在溶液中。2.pH变性改变体系pH值使杂蛋白变性3.有机溶剂变性使对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。（四）选择性变性沉淀法1.作用机理与有机溶剂类似，是发展较快的一种新方法。2.沉淀剂：非离子有机聚合物和聚电解质常用：聚乙二醇（Polyethyeneglycol，简写PEG），多用分子量大于4000的PEG。3.优点操作条件温和，不易引起生物大分子变性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。（五）其他沉淀法（复合沉淀法）小结：酶的沉淀分离借助于离心机产生的离心力分离不同大小、不同密度的物质（一）基本原理1.离心力

Fc=mac=mrω2=mr(2N/60)2

N为离心机每分钟转数

（r/min，rpm）表示方法一二、离心分离（centrifugation）Fc通常以相对离心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即离心力F的大小相当于地球引力（重力）的多少倍，一般用g（或数字g）表示RCF=mr（2N/60）2/mg=1.1210-5N2r此公式描述了相对离心力与转速N之间的关系

低速离心：以每分钟的转数表示，如：4000rpm

高速离心（超速）：常以相对离心力（RCF）表示，如：65000g。表示方法二二者如何选择？二、离心分离（centrifugation）2.沉降系数（sedimentationconstant）

单位离心力下颗粒的沉降时间，用S表示。

与分子量、分子密度成正比由于许多生物大分子的S值很小，所以定义1013s为一个沉降单位，1S=11013s。

常用S表示某些生物大分子、亚细胞及亚细胞器的大小，如16sRNA，蛋白质的沉降系数一般在1~200之间。二、离心分离（centrifugation）（二）离心机的种类二、离心分离（centrifugation）名称转速(r/min，g)注意事项低速离心机80001×104常温，注意样品热变性和离心管平衡高速离心机

8000-250001×104-1×105冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡超速离心机

>25000>1×105冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡实验室离心机温度类型：常温及冷冻使用冷冻离心机时提前降温，预冷离心头。离心机的大小：落地式及台式二、离心分离（centrifugation）（三）离心的形式角式水平式二、离心分离（centrifugation）离心头（转子）角式离心头要配套，低温使用要预冷，操作注意稳、盖、旋紧。二、离心分离（centrifugation）使用离心机时，应注意：平衡定温定速定时ABCD提交（四）离心机操作多选题1分（五）常用离心方法

差速离心沉降速度法密度梯度离心沉降平衡法：等密度梯度离心常用，各类离心机均可超速离心二、离心分离（centrifugation）

低速与高速离心交替进行，使沉降系数不同的颗粒分批分离的方法。

适用：分离分子量和密度差异较大的颗粒。

优点：操作简单。

缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒

2）壁效应严重，沉降的颗粒受到挤压。

用途：粗制品提取1．差速离心（differentialcentrifugation）差速离心实例

不同离心时间离心效果示意图（a）离心前的悬浮液（b）～（e）离心不同时间后颗粒的沉降情况又称速度区带离心样品在密度梯度介质中进行离心，使各组分得以分离的一种区带分离方法。

密度梯度介质：梯度介质溶解在一定的溶剂中，从而在离心管内形成一定的密度梯度。常用密度梯度溶液：蔗糖溶液，梯度预先配制。适用于超速离心机2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）

步骤：形成密度梯度，加样，离心，收集样品2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）

密度梯度离心示意图

特点：区带内的液相介质密度范围小于样品物质颗粒的密度。适用：分离密度相近而大小不同的物质。控制：在分子量最大的颗粒沉淀之前停止离心，可适当增大离心力，减少离心时间，防止区带扩散用途：分离核酸、蛋白质、核糖体亚基等成分2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）2.密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。

常用密度梯度溶液：铯盐溶液，梯度自发形成。适用于超速离心机3.等密度梯度离心

特点：区带内的液相介质密度范围包含样品物质颗粒的密度适用：分离大小相近而密度不同的物质控制：离心速度和时间应足够长3.等密度梯度离心

二、离心分离（centrifugation）（六）离心条件的确定离心力：RCF=1.1210-5N2r

离心时间：t=K/S

转子因子：K=(lnr2-lnr1)/ω2=Stt：沉降时间（s）S：颗粒沉降系数

ω：转子角速度

温度：多为4摄氏度

pH：酶稳定，无腐蚀二、离心分离（centrifugation）

过滤：借助过滤介质将不同大小、形状和特性的物质进行分离的技术。

分类：

非膜过滤：粗滤、微滤

膜过滤：微滤、超滤、反渗透、透析、电渗析三、过滤与膜分离过滤的分类及特性三、过滤与膜分离1.非膜过滤采用高分子膜以外的材料（滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等）作为过滤介质的分离技术2.膜过滤采用一定孔径的高分子薄膜作为过滤介质的分离技术分类：加压膜分离：微滤、超滤、反渗透电场膜分离：电渗析、离子交换电渗析扩散膜分离：透析（1）加压膜分离①微滤：微孔滤膜特点：截留直径为0.2-2µm的颗粒过滤除菌常用（1）加压膜分离②超滤：超滤膜

特点：截留直径为20Å

-0.2µm的颗粒超滤装置——实验室装置超滤装置——工业装置中空纤维系统超滤膜包超滤装置③反渗透：反渗透膜在高于溶液渗透压的作用下，依据其他物质不能透过半透膜而将其分离的技术。特点：截留直径<20Å

的颗粒2.电场膜分离使小分子的带电物质或离子在电场作用下移动并透过半透膜的分离技术（1）电渗析（2）离子交换膜电渗析脱盐3.扩散膜分离——透析（dialysis）利用分子扩散作用使溶质分子从高浓度一侧通过透析膜向低浓度一侧移动的分离技术主要用于除盐（1）透析膜特点：①

多孔薄膜，允许小分子通过，阻止大分子通过②化学惰性，多种溶液中不溶解（材料：纤维素衍生物等）③一定的机械强度透析膜规格选择：截留分子量（范围）、压平宽度（2）透析方法及装置色谱起源色谱组分植物色素石油醚碳酸钙颗粒用色彩（chroma）和图谱（graphs）组成色谱一词（Chromatography)。四、层析分离（色谱法，Chromatography）四、层析分离利用各组分的理化性质的不同，使各组分以不同比例分布在两相（固定相、流动相）中，当流动相流经固定相时，各组分以不同的速度移动，从而使不同组分得到分离纯化的技术。理化性质：相对分子质量、形状、吸附力、亲和力、分配系数、等电点等柱层析（ColumnChromatography）自动核酸蛋白

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液相色谱分析仪蠕动泵（恒流泵）层析柱紫外检测仪记录仪部分收集器低温层析柜现代化层析设备

——AKTA记录系统良好的线性放大四、层析分离凝胶层析离子交换层析疏水层析吸附层析亲和层析蛋白液相层析层析聚焦又称凝胶过滤层析、凝胶渗透层析、分子筛层析、分子排阻层析等以各种多孔凝胶为固定相，利用溶液中各组分的分子质量、形状不同而进行分离的技术。（一）凝胶层析（gelchromatography）1.基本原理大分子物质：不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先流出层析柱小分子物质：可自由出入凝胶孔，流程长而后流出层析柱（一）凝胶层析（gelchromatography）（一）凝胶层析（gelchromatography）凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Ka表示：

Ve-VoKa=————Vi

Vo：外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积

Vi：内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和

Ve：某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出层析柱，且色谱峰达到最高值时的洗脱液体积（一）凝胶层析（gelchromatography）

凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰：Ⅰ.Ka=0，即Ve=Vo：说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅲ.Ka=1，即Ve=Vo+VI：说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅱ.0<Ka<1：因分子大小而改变洗脱峰的位置，Ka小的先流出，Ka大的后流出。

分配系数Ka的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Ka差异大，分离效果好，Ka差异小，分离效果差。思考：Ka>1??体系中存在其他层析（吸附层析、离子交换层析等）（一）凝胶层析（gelchromatography）2.凝胶的种类和性质——多孔网状结构交联葡聚糖凝胶（dextrangel)琼脂糖凝胶（agarosegel)聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegel）（一）凝胶层析（gelchromatography）3.凝胶过滤层析的操作（1）凝胶的选择和处理（2）层析柱的选择（3）装柱（4）上柱（5）洗脱（6）胶的保存（一）凝胶层析（gelchromatography）91（一）凝胶层析（gelchromatography）4.应用脱盐溶液浓缩生物大分子物质的分离纯化分子量的测定（一）凝胶层析（gelchromatography）

利用离子交换剂上的可解离基团对各离子的亲和力不同进行分离的技术。（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）1.基本原理（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）2.离子交换剂由载体、可解离基团（电荷基团和反离子）构成纤维素琼脂糖葡聚糖

树脂

载体

电荷基团

—O—CH2—COO-—H+反离子（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（1）离子交换剂的类型阴离子交换剂：二乙氨基乙基DEAE－C2H4N+(C2H5)2H二乙氨基乙基2-羟丙基QAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3阳离子交换剂：羧甲基CM—CH2COO－磺丙基SP—C3H6SO3－（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）

化学原料合成：树脂类物质

载体天然材料制成：cellulose、sephadex、sepharose

阳离子交换剂：电荷基团（－）,反离子（＋）

可解离基团

阴离子交换剂：电荷基团（＋）,反离子（－）

例：DEAE-Sephadex，CM-Sepharose（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（2）离子交换剂的选择

强、弱离子交换剂的选择：强型：适用的pH范围广弱型：适用的pH范围窄

阴、阳离子交换剂的选择：酶的稳定性若<pI稳定，蛋白质带正电荷，用阳离子交换剂若>pI稳定，蛋白质带负电荷，用阴离子交换剂（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（3）平衡常数K（分配系数）组分离子在离子交换剂上的浓度（mol/g）K=组分离子在溶液中的浓度（mol/mL）衡量离子交换剂的活性基团与组分离子的亲和力K值越大，亲和力越大，越易被离子交换剂吸附，在体系内保留时间越长根据K值之间的差异进行分离（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）3.操作平衡上柱（冲平）去吸附分离结束再生+低盐高盐利用不同盐浓度将不同蛋白质洗脱下来Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）4.应用：制备纯化生物大分子5.影响离子交换层析的主要因素pH离子强度：分离样品需经脱盐处理层析介质（流速、分辨率）（二）离子交换层析（ionexchangechromatography,IEC）又称疏水作用层析

疏水层析介质和蛋白质分子都具有一定的疏水性质，根据被分离成分与固定相之间疏水力大小的不同而进行分离。从分离纯化的机制看，属吸附层析类。（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）让蛋白质与疏水性固定相结合在一起，可以靠蛋白质表面的一些疏水补丁，或让蛋白质分子内的疏水性残基暴露出来。在高盐浓度下，蛋白质发生局部结构可逆改变，被迫与疏水层析的固定相结合在一起，通过降低流动相的离子强度可将结合于固定相的蛋白质，按结合力大小依次进行解吸附。基本原理（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）

2.吸附剂：基质+配体

亲水性（如Sepharose）

基质疏水性（如硅胶、树脂）

配体（疏水性基团）：丁基、苯基、辛基、烷基（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）3.操作加样：样品溶液中补加适量的盐。洗脱：用降低盐浓度的平衡缓冲液洗脱。再生：除去固定相吸附的杂质，用水或8mol/L脲素溶液。4.应用主要用于分离纯化大分子物质（与离子交换层析互补）。（三）疏水层析（HydrophobicInteractionChromatography）与离子交换层析比较？1.基本原理利用固体吸附剂对不同组分间吸附力（及洗脱液对它的解吸作用）的差异进行分离。（四）吸附层析（adsorptionchromatography）吸附作用的强弱主要与吸附剂和被吸附物质的性质有关。吸附层析的关键是吸附剂和洗脱剂的选择。（四）吸附层析（adsorptionchromatography）2.吸附剂根据吸附能力强弱分为：弱吸附剂：蔗糖、淀粉中等吸附剂：碳酸钙、磷酸钙、硅胶等强吸附剂：氧化铝、活性炭根据材料分为：无机吸附剂/有机吸附剂（四）吸附层析（adsorptionchromatography）3.洗脱剂极性组分：极性洗脱剂非极性组分：非极性洗脱剂注意：纯度高、稳定性好、溶解度大、流动性好4.洗脱方法溶剂洗脱法：单一/混合溶剂洗脱置换洗脱法：置换剂取代洗脱前缘洗脱（分析）法：待分离溶液洗脱（四）吸附层析（adsorptionchromatography）相似相溶原理由吸附层析发展起来的，是从复杂混和物中纯化蛋白质的最好方法。又称：

功能层析（functionchromatography）

生物专一吸附（biospecificadsorption）

选择层析（selectivechromatography）（五）亲和层析（AffinityChromatography）1.基本原理利用生物大分子与配体之间的特异性的、可逆的亲和力，对生物分子进行纯化。2.特点分辨率高，分离速度快操作简单，对设备要求不高亲和吸附剂通用性差，价格高洗脱条件苛刻（五）亲和层析（AffinityChromatography）（五）亲和层析（AffinityChromatography）+CCC配体蛋白质配基固相化亲和吸附固体载体解吸附3.亲和层析剂（1）载体的选择

常用载体：琼脂糖凝胶、聚丙稀酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素等。（2）配体的选择

常用配体：抑制剂、底物、抗体、辅酶等。

优良配体须具备的条件：①与待纯化的物质有较强的亲和力。②具有与基质共价结合的基团。（五）亲和层析（AffinityChromatography）目的产物

相应的配体

酶抗体凝集素激素DNA/RNA底物、抑制剂、辅酶（辅因子）抗原、病毒、细胞多糖、糖蛋白、细胞受体受体、载体蛋白互补片段目的产物与相应的配体（五）亲和层析（AffinityChromatography）（3）偶联（亲和吸附剂的制备）配体一定，改造载体①载体活化不同的载体活化需要不同的活化剂。常用：溴化氰（CNBr）、环氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸盐、苯醌等。（五）亲和层析（AffinityChromatography）②引入连接臂（spacearm）——连接小分子物质

又称手臂（spacer）

“接臂”的目的：克服影响配体与生物大分子的结合的空间障碍。

“接臂”的途径：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前带有各种手臂的系列载体已有商品供应。如：AH-Sepharose4B（五）亲和层析（AffinityChromatography）常用手臂（五）亲和层析（AffinityChromatography）4.操作（1）层析前：选择亲和层析剂选择根据欲分离物质特性配体选择根据配体分子大小及基团特性载体（2）装柱、平衡、上样（3）洗脱：能削弱酶和亲和吸附剂间的相互作用。包括：非专一性洗脱和专一性洗脱偶联亲和层析剂（五）亲和层析（AffinityChromatography）

非专一性洗脱改变温度改变pH值改变离子强度

专一性洗脱：竞争性洗脱剂（半抗原、抑制剂、底物类似物等）

被吸附物质结合竞争性地与

配体结合（五）亲和层析（AffinityChromatography）5.分类及应用（1）纯化标签（tag）蛋白——金属离子亲和层析如：带有His-tag，GST-tag蛋白纯化（2）抗体及Fc融合蛋白纯化——免疫亲和层析

ProteinA：

来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合的结构域

ProteinG：源自链球菌G族的细胞表面蛋白，为三型Fc受体。作业1：作用原理作业2：作用原理（五）亲和层析（AffinityChromatography）PrinciplesofOperationforChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinity五、电泳技术（electrophoresis，EP）带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。根据各种带电粒子在电场中迁移速度（迁移率）的不同而对物质进行分离的技术。用途：酶的纯度鉴定、分子量测定、等电点测定、少量酶的分离纯化1.基本原理在一定pH条件下，不同带电性质、带电量、颗粒大小和形状的颗粒在电场中的移动方向和速度（迁移率）不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。+-五、电泳技术（electrophoresis，EP）（1）迁移率与内在特性和外界条件有关

内在特性：颗粒性质（净电荷量，颗粒大小形状）

外界条件：电场强度、溶液性质、支持体特性（2）影响迁移率的因素

颗粒性质：体积越小，越接近球形，静电荷越多

电场强度：越高

溶液性质：离pI越远；离子强度越高五、电泳技术（electrophoresis，EP）界面电泳（又称移动界面电泳，movingboundaryelectrophoresis，MBEP）：在没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳（zoneelectrophoresis，ZEP）：有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用：防止电泳过程中的对流和扩散。2.分类五、电泳技术（electrophoresis，EP）按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸定性定量分析。②醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。五、电泳技术（electrophoresis，EP）③琼脂糖凝胶电泳一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。④聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测，分辨率较高。

聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。五、电泳技术（electrophoresis，EP）3.电泳常用设备

（1）电泳仪：为电泳提供稳定直流电源的装置。常压电泳仪（600V）高压电泳仪（3000V）超高压电泳仪（30000V～50000V）（2）电泳槽自由界面电泳槽管状电泳槽板状电泳槽（3）附属设备五、电泳技术（electrophoresis，EP）聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳等电聚焦电泳双向电泳思考：电泳后得到的蛋白条带能否回收？如何回收？五、电泳技术（electrophoresis，EP）（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。1.基本原理丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr）交联剂：N，N’-甲叉双丙烯酰胺（methylanebisacrylamide，简称Bis）催化剂：过硫酸铵（ammoniumpersulfate，AP）加速剂：TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）2.分离效应PAGE根据其有无浓缩效应，分为：连续电泳（continuouselectrophoresis）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳（discontinuouselectrophoresis）：采用不同孔径的凝胶和不同缓冲系统

电荷效应不连续PAGE分子筛效应

浓缩效应连续PAGE（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

浓缩效应：样品在浓缩胶中浓缩成一条窄带，再进入分离胶分离。

电荷效应：分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。

分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。

HCl、甘氨酸作用？目前测定蛋白质亚基相对分子量（molecularweight,Mw）的最好方法。（二）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）1.基本原理

巯基乙醇：还原二硫键，破坏蛋白质二级结构

SDS：带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过天然蛋白质原有的电荷，因而消除或掩盖不同种类蛋白质间原有电荷的差异。

SDS：破坏蛋白质氢键、疏水键，引起蛋白质构象改变，使蛋白质-SDS复合物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm），长轴与蛋白质分子量成正比。蛋白质-SDS复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与蛋白质分子量有关。蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：lgMw=lgK-bmMw：分子量；m：迁移率；K、b均为常数（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）2.操作：（SDS及PAGE）制胶:分离胶/浓缩胶样品制备：PAGE:样品＋样品缓冲液（蔗糖/甘油、溴酚蓝）SDS:样品＋样品缓冲液（SDS、甘油、

巯基乙醇、溴酚蓝）。加样及电泳：加入电泳缓冲液，加样，通电，溴酚蓝距下端一定距离时停止电泳。染色及脱色（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulphate-polyacrylamidegelelectrophoresis,SDS-PAGE）利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，在其中加入两性电解质载体的电泳方法。

1.基本原理两性电解质载体在电场作用下，形成从阳极到阴极逐渐增加的平滑和连续的pH梯度。蛋白质在此pH梯度凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时不再泳动，被浓缩成狭窄的区带。（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)2.两性电解质载体（carrierampholytes）（1）易溶于水，有足够的缓冲能力——以便保持稳定的pH梯度（2）导电性能好——以保持电场强度的均匀性。（3）分子量小——电泳后易分离除去。（4）化学组成不同于蛋白质——不干扰测定。（5）性质稳定——不与样品发生反应。商品名：Ampholine，一种含有各种连续

pH梯度的小分子混合物（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)3.操作：

凝胶配制：两性电解质载体浓度为2.5％~5%

加样：凝胶表面任意位置，或制胶时加入

电泳：

阳极：磷酸溶液电极溶液阴极：NaOH溶液只有在凝胶两端给予高电压（600V）和足够的电泳时间（12h）时，才能获得较好的分辨率。（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)固定及染色：TCA固定，考马斯亮蓝染色。（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)3.应用：等电点测定Marker与未知样品同时电泳染色后，以pH值为纵轴，距阴极距离为横轴，做pH梯度标准曲线，据未知蛋白迁移距离可推知pI。IEF测定蛋白质pI（三）等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)第四节酶的成品加工酶的浓缩酶的干燥酶的结晶（一）蒸发浓缩（易变性，较少使用）

减压蒸发浓缩的简易装置一、酶的浓缩（酶与溶剂分离）

旋转蒸发仪（二）超滤浓缩

浓缩以压力差为动力，将待浓缩溶液通过超滤膜，酶分子较大被滞留，水分子和小分子选择性透过，达到浓缩目的。一、酶的浓缩（酶与溶剂分离）

（三）胶过滤浓缩利用葡聚糖凝胶Sephadex、