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本文格式为Word版,下载可任意编辑——IPTG诱导蛋白质表达试验步骤总结试验总结
IPTG诱导表达蛋白
15-11-3
配固体培养基和液体培养基,灭菌。
配BindingBuffer和脱盐液各500ml。在400ml体积时调理溶液pH值至7.4,定容后转移到试剂瓶中。溶液使用前要抽滤(滤除溶液内的气泡和不溶性杂质)。倒板:(5个灭菌的培养皿)
①微波加热溶解固体培养基(每次加热30s,待有沸腾的迹象时,减少加热的时间)。
②超净台操作,以1?1000的比例(1ml培养基~1μl抗生素)向培养基中参与Kan+抗生素(50mg/ml),摇匀。
③倒板。
④培养皿放置在超净台上凝固,凝固后将培养皿倒着放入培养箱中。15-11-4
热转化:(将质粒导入大肠杆菌中)
①提前将大肠杆菌(冰上溶化)和质粒拿出来溶化,混合(冰上操作)后冰上放置30min。
②42℃热水浴1min(超过90s会损伤细菌),取出后马上放在冰上冷却2~3min,参与1mlSOC培养基。
③摇床上摇45min,150rpm,37℃。(使菌体复苏)
④离心,3000rpm,3min。
⑤涂板:取200μl上述液体,喷到板上,用玻璃涂布棒涂匀,放入培养箱中30min晾干后倒着放置。(12~16h)15-11-5
配IPTG(0.2g/ml),用灭菌水,超净台操作。
挑单克隆:(将细菌放入培养液中,以便进行扩大培养和后续试验)①提前准备好几支装有3ml培养基的试管,每管参与3μlKan+抗生素(50mg/ml),塞好塞子,试管倾斜,是抗生素溶入培养液中。(塞子开启前和塞好后都要在酒精灯上过火灭菌)。
②小镊子过火灭菌后,夹取一个枪头,在培养皿上挑一个单个的菌落,轻轻划过。将带有菌落的枪头放入试管中,塞好塞子
③将试管放在摇床中培养一晚,37℃,250rpm。(尽量不超过12h)
注意:操作尽量在靠近酒精灯的地方进行。15-11-6扩大培养、诱导表达
①以(抗生素?培养基)1?1000的比例向培养基中参与Kan+抗生素,摇匀后再参与(每100ml培养基)1ml单克隆溶液,摇匀。
②摇床上放置2.5h,37℃,180rpm。
③以48μlIPTG/100ml培养基的比例参与IPTG诱导,移去牛皮纸,恒温摇床上摇6h,30℃,180rpm。冰上放置一晚(抑制细胞生长速率,有利于蛋白质充分折叠)
15-11-6
离心收集细菌:将培养液倒入50ml离心管中,8000rpm,离心5min,弃上清。沉淀加水冲洗混匀,再离心,弃上清。加PBS冲洗混匀,离心,弃上清。加PBS混匀,将溶液移入PU管中,-20℃保存。15-11-7破碎、离心细胞
①4ml细胞液用超声破碎3~4次(探头不能碰见管底和管壁,且离管底1cm左右,4~7ml),至溶液透明。
②将溶液分装到1.5ml离心管中,(10000rpm,4℃,10~15min)离心2~3次至没有白色沉淀。蛋白质纯化脱盐
①离心后得到的上清液用针筒抽取过膜,先后用镍柱纯化、脱盐柱脱盐(柱子不能干,不能有气泡)。
两者也可同时进行镍柱:水洗→Binding→加蛋白→Binding→Elution
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