凝固酶阴性葡萄球菌

凝固酶阴性葡萄球菌、立题依据凝固酶阴性葡萄球菌（）广泛存在于人体皮肤、黏膜等组织表面，常在血液、痰液、尿液、深静脉置管等各种标本中检出。文献报道，年美国个医学中心份血标本中，的分离率达。尽管血液等无菌体液培养出临床意义较大，但据报道单次血培养污染的可能性仍高达。第一部分研究背景和意义2近年来由于介入性诊疗操作、免疫抑制剂与广谱抗生素的广泛使用，已成为院内感染的重要病原菌，而且耐药菌株比金黄色葡萄球菌更为多见。叶联华等报道人工瓣膜术后心内膜炎中，约有由凝固酶阴性葡萄球菌引起；年中国细菌耐药监测结果检出率平均为,大于的。研究背景和意义3作为皮肤黏膜定植菌，在越来越多的标本中被分离出来，常常引起临床困惑。其是否能作为感染的病原菌是临床关心的问题。有鉴于此，实验室建立对污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是临床明确诊断和制定合理治疗方案的重要前提。研究背景和意义4致病物质在感染的发病过程中，细菌先黏附继而形成难以清除的生物膜是其最为重要的致病机制；其中产生的多糖胞间黏附素（，）是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质，在感染过程中起重要的作用，是鉴定其致病性的物质基础。等发现操纵子对合成以与在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。研究背景和意义5基因结构基因座定位于细菌染色体，全长，包括调节基因与串联存在的、、和结构基因。其中，个基因构成一个操纵子，可以通过检测基因来反映操纵子的存在。不直接参与胞间黏附素的合成,因为重组就能使细胞积聚；单独呈现低的乙酰葡糖胺转移酶活性；涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞表面；生物膜的形成要求编码的产物具有最佳活性。因此,我们选择了作为本试验的目的基因片段。研究背景和意义6获得特异的致病性分子标志物；确立敏感、准确、快速的医院感染相关性特异基因诊断方法；能够准确鉴定致病性与非致病性。研究背景和意义、实验目的7研究的生物标志物对该菌在医院获得性感染中的临床微生物学诊断与鉴定，追踪传染源，探索其在医院感染中的确切作用和地位、传播与感染规律，从而对控制传播途径、建立准确有效的防治措施具有重要实际意义和经济价值。研究背景和意义、临床意义8阴性对照：表皮葡萄球菌，购自中国药品鉴定所，经基因组测序证明其操纵子缺失；阳性对照：表皮葡萄球菌，瑞金医院倪语星教授惠赠，含有完整操纵子；待测样本：自年月至年月，收集我院临床各科室共例疑是感染性标本。第二部分材料和方法、研究对象9、主要试剂培养基：哥伦比亚琼脂培养基、刚果红琼脂培养基、肉汤增菌液。引物：引物（‘’与‘’）；引物（‘’及‘’）；引物（‘’及‘’）。材料和方法10、主要仪器设备仪：仪，美国.；恒压恒流电泳仪、电泳槽：型，北京东方特力科贸中心；凝胶成像系统：，美国.；核酸蛋白定量仪：，美国；酶标仪：美国雷杜，深圳组装；：法国é；生物安全柜：Ⅱ，济南鑫贝西生物技术有限公司；全自动快速微生物培养检测系统：，法国é；材料和方法11、实验设计与方法标本采集阴、阳性对照菌种鉴定检测扩增基因基因序列生物膜形成实验测序、生物信息学分析确定特征片段临床验证比较分析材料和方法12图：部分样品刚果红试验结果、刚果红试验第三部分结果和讨论13表:例的菌种组成与刚果红试验结果结果和讨论14刚果红试验通过培养后菌落的颜色变化来反映表达多糖胞间黏附素的情况，进而间接地反映其致病性。例样品中刚果红试验阳性率，由于分泌的在培养过程中可以丢失，使阳性结果偏低；另外，其方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。

结果和讨论15、基因片段的扩增a

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cdefg20001000500250(bp)图：部分样品的基因片段的扩增结果结果和讨论16表:例不同菌种片段扩增的结果结果和讨论17结果和讨论18图:部分样品的定性黏附性实验结果、体外黏附性实验结果和讨论19

表:例（）菌株半定量黏附性实验结果结果和讨论20通过体外半定量黏附实验测得（）（）菌株是粘附株。可见以半定量黏附试验结果作为生物膜形成能力的判定标准，操纵子的存在与粘附与其生物膜形成密切相关。体外黏附性实验用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏；且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性，不适合临床常规应用。结果和讨论21、与基因片段扩增a

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20001000500100(bp)图：部分样品的片段扩增结果结果和讨论22图：部分样品的片段扩增结果a

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cde20001000500250(bp)结果和讨论23图：部分样品扩增产物的测序图谱结果和讨论24例样品进行了基因与基因片段的扩增，电泳检测结果显示全部样品均能准确地扩增出相应的片段，其片段大小分别为及，且均为单一条带；序列测定表明所有样品及产物序列均相同，未发现与感染相关的特异性分子序列。结果和讨论25操纵子可出现在多种中，临床实验室建立并常规进行致病性分子标志物的检测方法是有意义、有必要的；通过本实验我们确立了的敏感、准确、快速的医院感染相关性基因诊断新方法，即基因扩增方法；第四部分结论26结论本研究首次报道了除表皮葡萄球菌以外的其他种的凝固酶阴性葡萄球菌产生多糖胞间粘附因子的情况；表皮葡萄球菌在临床中检出最多，是携带操纵子的主要菌种，其致病性应引起足够重视；