药学5.核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术第一节

核酸分子杂交的基本原理原理：碱基互补配对原则

一、核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)

来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。杂交可分成：DNA/DNA、RNA/RNA、DNA/RNA之间的杂交。复性RNADNA待测核酸序列探针(probe)：已知核酸序列二、DNA的变性(denaturation)

定义：在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。方法：过量酸、碱、加热、变性试剂如尿素、甲酰胺以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等。

变性后其它理化性质变化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失DNA变性的本质是双链间氢键的断裂

例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。热变性解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线。目录Tm：变性是在一个相当窄的温度范围内完成，在这一范围内，双链DNA变性一半所需要的温度称为DNA的解链温度，又称熔解温度(meltingtemperature,Tm)。其大小与G+C含量成正比。Tm=（G+C）%×0.41+69.3三、DNA的复性DNA复性(renaturation)的定义

在适当条件下，变性DNA的两条互补链可恢复天然的双螺旋构象，这一现象称为复性。

热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing)。减色效应DNA复性时，其溶液OD260降低。DNA-DNA杂交双链分子变性复性不同来源的DNA分子复性的速度受到诸多因素的影响：1.核酸分子的浓度：一般适宜的探针浓度为0.1～0.5μg。2.核酸分子的长度：核酸探针的长度控制在50～300bp3.温度：适宜的复性温度是较Tm值低25℃。4.离子强度：离子强度过低，不利于复性。5.核酸分子的复杂性。第二节

核酸分子杂交的基本方法核酸分子杂交的类别（一）DNA印迹技术(Southernblotting)

用于基因组DNA的定性定量分析、酶切图谱分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析（RFLP）等。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)

用于RNA的定性定量分析。

蛋白质的印迹分析(Westernblotting)

用于蛋白质定性定量及相互作用研究。其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)（一）Southern印迹杂交

DNA印迹E.Southern 1975年方法1.酶解DNA限制性内切酶（RestrictionEnzyme,RE）限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）在人类基因组中，平均约200对碱基可发生一对变异（称为中性突变），中性突变导致个体间核苷酸序列的差异，称为DNA多态性。不少DNA多态性发生在限制性内切酶识别位点上，酶切水解该DNA片段就会产生长度不同的片段，称为限制性片段长度多态性。2.分离电泳

在电场中带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electrophoresis）。

＋－=－＋－3.凝胶中核酸的变性碱变性中和处理4.转膜硝酸纤维素膜尼龙膜转膜方法毛细管虹吸印迹法电转印法真空转移法毛细管虹吸印迹法

电转印法

真空转移法5.杂交预杂交：封闭非特异性DNA位点。杂交6.杂交结果的检测放射自显影照片Southern印迹的应用基因诊断法医学

DNA的多态性。微卫星DNA和小卫星DNA等是重要的多态性标志。单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)

DNA指纹（DNAfinger-print）分析的基本流程如下：DNA的提纯与纯化→限制性内切酶消化→电泳分离→分子杂交→指纹图的显示假设一对夫妻，生了一男一女，又领养了一个女孩，妻子还带来与其前夫所生的女儿。这一家人的DNA指纹如图所示。由此可推断出：A和C是亲生儿女；B为妻子和其前夫所生；D为养女

（二）Northernblot和Southernblot不同在于：A：靶核酸是RNA；B：RNA电泳时，凝胶中加入变性剂，防止

RNA分子形成二级结构；C：电泳结束后直接转膜。一、原理三种印迹技术的比较

(三）原位杂交(insituhybridization)

原位杂交是将分子杂交与组织化学相结合的一种技术。它是利用标记的已知核酸探针，在组织、细胞及染色体上检测特异的DNA或RNA序列的核酸杂交技术。主要过程：⑴制备标记的核酸探针:

长度一般为50～300bp。⑵标本的制作与处理:

注意防止核酸丢失、保持形态结构、保证探针穿透到达靶区。⑶原位杂交:DNA探针杂交可在2-4小时内完成，而RNA探针杂交则应过夜。⑷杂交信号的显示和结果分析。

1.斑点印迹杂交(dotbloting)将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上优点：简单、快速、可同时检测多个样品2.原位杂交(insituhybridization)将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。特点能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态核酸原位杂交的基本步骤细胞或组织的固定：载玻片组织细胞杂交前的预处理用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质探针的选择和标记杂交杂交结果检测荧光原位杂交图

（四）溶液杂交(Solutionhybridization)核酸酶S1保护分析法(nucleaseS1protectionassay)RNA酶保护分析法(RNaseProtectionAssay，RPA)1.核酸酶S1

保护分析法合成单链DNA探针与RNA样品进行杂交DNA/RNA核酸酶S1降解DNA和RNA单链放射自显影2.RNA酶保护分析法制备标记RNA探针RNA/RNA与待测RNA杂交RNaseT1和RNaseA降解单链RNA电泳第三节探针

探针(probe)

一小段用同位素、生物素或荧光染料等标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。一、核酸探针的来源

基因组DNA探针

cDNA探针

RNA探针寡核苷酸探针组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合*基因组DNA文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库逆转录酶载体受体菌复制*cDNA文库逆转录酶AAAA

TTTT

AAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录二、核酸探针的标记物•①高度灵敏性；②标记物与核酸探针结合，应绝对不能影响核酸探针与模板的结合能力及结合的特异性；③当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性（Km值）无多大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；④高度特异性；⑤较高的化学稳定性，保存时间长，标记及检测方法简单；⑥对环境无污染，对人体无损伤；⑦价格低廉等。常用的探针标记物：放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。非放射性同位素：荧光、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。放射性核素标记物（灵敏度极高）①32P：释放β-粒子,能量高,穿透力极强。②35S：35S的放射性亦较强，但β-粒子能量较低，因此其检测灵敏度较32P稍低。③3H：适用于细胞原位杂交。④125I和131I：碘放射性同位素在70年代曾被广泛应用于核酸探针的标记。非放射性标记物无放射性污染，稳定性好①半抗原：生物素、地高辛②配体：生物素③荧光素：④化学发光物质，可以像放射性核素一样直接对X光胶片进行