AB7500荧光定量PCR仪使用维护校准标准操作规程

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⑦抬起门栓，然后将受热的护盖门推到仪器的后面。

⑧使用少量的双蒸水，清洁样本块中被污染的反应孔：a.用移液管吸取少量双蒸水并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的双蒸水数次，以冲洗反应孔。c.将用过的双蒸水水吸入废液瓶中。

d.使用棉花拭子，擦试每个被污染的反应孔的内壁。e.使用无绒布料，吸出剩余的双蒸水。

⑨7500Real-TimePCRInstrument将受热的护盖门拉到仪器的正面。抬起门栓，然后将受热的护盖门紧固到交织杆。

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⑩开启7500Real-TimePCRInstrument的检查门。

?插上电源插头并开启7500Instrument。

?通过执行背景校准运行确认已消除污染（参阅5.4.2“背景校准〞）。

?假使污染依旧存在，重复步骤②至⑦，然后使用95%乙醇溶液清洁样本块中受污染的反应孔：a.用移液管吸取少量95%乙醇溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的乙醇溶液吸入废液瓶中。

重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用双蒸水冲洗反应孔。?重复步骤⑧至?，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。

?假使污染依旧存在，重复步骤②至⑦，然后使用10%漂白剂溶液清洁样本块中受污染的反应孔：

a.用移液管吸取少量10%漂白剂溶液并滴入每个受污染的反应孔中。b.抽吸并滴入反应孔中的溶液数次，以冲洗反应孔。c.将用过的漂白剂溶液吸入废液瓶中。

重要！使用漂白剂溶液或乙醇溶液清洁反应孔之后，应始终使用去离子水冲洗反应孔。?重复步骤⑧至?，以冲洗样本块的反应孔，并验证已清除掉污染物。假使仍有污染，请与生产商技术支持联系。

?确保受热盖门完全关闭并上闩。假使没有，则7500Software显示错误消息。

5.3.4.2移动PCR仪。（更换或移动光学器件的任何部件后，必需执行ROI校准、背景校准、光学校准、

染料校准以及RNaseP仪器验证。）

5.3.4.3更换卤素灯。

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①全程戴上一次性无粉手套操作。

②关闭7500Instrument，然后拔下其电源电缆。允许仪器冷却15分钟。

a.注意！灼热。7500Instrument和灯具灼热！灯具在使用中会变得十分灼热。在处理灯具之前，应允许灯具冷却15分钟，并戴上无粉防护手套。

b.重要！为避免灼伤及缩短新灯具的使用寿命，处理灯具时请戴上一次性无粉手套。c.注意！7500Instrument按设计仅可使用12V、75W的卤素灯。③开启7500Instrument的检查门。

a.将薄型螺丝刀插入检查门边缘处的键销孔内，然后推动以解开门栓。b.开启仪器前门。

④从仪器中取出灯具：a.向下滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地抓住卤素灯并向上提，使灯具从安装槽口中脱出。

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ab

⑤查看灯具并确定有无故障迹象（有故障的灯具内壁上寻常有碳黑层）。

⑥将新灯具安装至仪器上：a.向上滑动灯具释放杆。

b.用手紧紧地握住灯具，将灯具放入带槽口的安装座内，然后防备地向下滑动灯具，使其到位。

⑦关闭仪器前门。

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⑧插上电源插头并开启7500Instrument。⑨开启ROIInspector对话框：

a.在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

b.在InstrumentMaintenanceManager的ROI选项卡中，单击StartManualCalibration。⑩在ROIInspector对话框中，选择LampControl→Idle。

?当仪器运行时，通过检查门上的缝隙观测，确保灯具发光，然后单击Done。

?假使灯具发光，在7500Software中选择Instrument→LampStatus/Replacement，单击ResetLampTimer，然后单击OK。假使灯具不发光，则替换的卤素灯可能有缺陷。重新更换灯具。假使再次更换灯具后仍不发光，检查仪器的保险丝是否存在故障（参阅第71页）。?更换灯具后，按顺序执行以下校准。请参阅：?5.4.1目标区（ROI）校准?5.4.2背景校准?5.4.3光学校准?5.4.4染料校准?5.4.5验证仪器性能

5.3.4.4更换7500Instrument保险丝。

①保险丝损坏时，更换7500Real-TimePCRInstrument保险丝。（注意！为在长时间内防止火灾，更换保险丝时请使用类型和额定值与仪器原始保险丝一致的经认可的保险丝。）②全程戴上一次性无粉手套操作。③关闭仪器电源，并拔下电源插头。

④使用平口螺丝刀从仪器上旋松并卸下保险丝座。

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单击StartCalibration。

5.4.4.6依照向导的指示，完成每个反应板的校准。（重要！在每个校准中，向导将单独指示。必需独立

设置、运行和分析每个染料反应板。）DyeCalibration对话框显示四个选项卡：?Overview–显示校准相关信息。当软件提醒获取需要的材料时，选择要校准的染料。?Setup–显示染料校准设置说明。单击Next提醒可以开启Run选项卡。当软件提醒装入染料反应板时，依照步骤5.4.4.10所述准备并装载反应板。

?Run–单击STARTRUN可以开始校准流程并显示处理消息。单击Next提醒可以开启Analysis选项卡。

?Analysis–指明校准状态(Passed/Failed)。当软件提醒分析从每个染料反应板采集的光谱时，核实校准的状态：

?Passed－7500Instrument校准通过。转到步骤5.4.4.11的②。

?Failed－7500Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〞。

注：开始校准之前，仪器可能暂停一段时间（最多可达10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。

5.4.4.7将软件所需的染料反应板从其包装中取出。振荡反应板5秒钟。（重要！不要丢弃存放反应板的

包装袋。若贮存于原包袋中，反应板最多可重复使用3次。

5.4.4.8用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必需充分混合并离心。确认反应板每个背景反应孔

中的液体均位于反应孔底部。假使不是，则以更长的时间离心反应板。

5.4.4.9检查并确保要装入的染料反应板与在7500Software中选取的荧光匹配。

5.4.4.10按压托盘门，将其开启。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配

器中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。（注：假使无法开启托盘，样本块可能位于其“升高〞位置，锁定了托盘位置。要降低样本块，选择Instrument→Calibrate，然后退出ROIInspector。）

5.4.4.11由于向导对每个染料校准单独提供指示，所以请对校准的每个染料执行以下程序。

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①②a②b③①验证校准状态：

?Passed－7500Instrument校准通过。转到b）。

?Failed－7500Instrument校准失败。请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〞。②核实染料光谱的分组：

a.在反应板布局中，选择反应板的孔。b.检查原始数据。对于每个光谱，请确认峰值：?位于7500Instrument的可检测范围内。?无不规格光谱峰值。?出现在染料的正确通道上。

假使某光谱不符合上述标准，请参阅5.4.4.15“排除染料校准故障〞。

注：在含有一致染料的各反应孔中，光谱位置和峰值位置的差异是由于不同反应孔之间的光学属性及激发能存在微弱差异而引起的。③若所有光谱均可接受，则单击Next。

5.4.4.12取出校准反应板：（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。若刚使用过

仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）①按压托盘门，将其开启。②取出校准反应板。③按压托盘门，将其关闭。

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④将校准反应板放入其包装套中。将放入包装套的反应板放回贮存在冷冻柜内的光谱校准套件中。（注：假使将7500Real-TimePCRInstrument染料反应板贮存在其原始包装内并放在冷冻柜中，则在开启包装后6个月内可以校准7500Real-TimePCRInstrument最多3次。）

5.4.4.13在依照指示将染料反应板取出后，单击Finish。5.4.4.14依照5.4.4.1开始操作，准备并运行下一个反应板。滤光器1峰值(nm)-520染料/光谱FAM染料SYBRGreen染料2-550JOE染料VIC染料3-580CY3染料NED染料TAMRA染料4-610ROX染料TEXASRED染料

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5-670CY5染料5.4.4.15排除染料校准故障

问题/病症可能原因行动1.卸载7500Instrument并查看光谱校准反应板的反应孔。若反应孔中的液体不是：–位于反应孔底部，请将反应板离心更长时间，然后重复执行校准。–体积相等，则说明反应板未密封致使试剂挥发。请将其丢弃，并运行另一反应板。2.若光谱校准反应板显示正常，则丢弃该反应板并运行另一块反应板。3.假使问题仍旧存在，请与生产商联系。注：若正运行定制光谱校准反应板，请创立另一反应板但要增加产生不足信号的染料的浓度。请依照5.4.2“背景校准〞操作，以确认是否存在污染物。若背景校准未显示样本块含有污染物，则光谱校准反应板可能含有污染物。注：若正运行定制光谱校准反应板，请创立另一反应板但要降低超过可检测限量的染料的浓度。一个或多个原始光?光谱校准反应板未充分开谱达到或低于校准心。的可检测阈值。?光谱校准反应板含有陈旧试剂或试剂体积不足。?若正运行定制光谱校准反应板，染料可能浓度不足。一个或多个原始光?样本块或光谱校准反应板含谱超过7500有荧光污染物。Instrument的最高?若正运行定制光谱校准反应限量。板，染料可能浓度过大。光谱在一个以上的样本块或光谱校准反应板含滤光器中含有峰有荧光污染物。值。5.4.5验证仪器性能

5.4.5.1全程戴上一次性无粉手套操作。

5.4.5.2冷冻柜中取出TaqMan?RNaseP96-WellInstrumentVerificationPlate，然后让反应板温度上

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升到室温（大约需要5分钟）。

5.4.5.3从包装袋中取出RNaseP反应板。振荡反应板5秒钟。

5.4.5.4用板式离心机将反应板离心2分钟。反应板必需充分混合并离心。确认液体位于反应板每个反

应孔底部。假使不是，则再次以更长的时间离心反应板。（重要！注意不要让RNaseP反应板的底部染上尘污。反应板底部沾上的液体和其它污染物可污染样品区组，导致异常高的背景信号。）

上图为RNaseP反应板上标准和未知种群的分布状况。RNaseP反应板包括五个重复组的标准物（1250、2500、5000、10,000和20,000拷贝）、两个未知重复组（5000和10,000拷贝）和阴性对照反应孔(NC)。

5.4.5.5按压托盘门，将其开启。将反应板装入仪器中的反应板架。确保放置时反应板在反应孔板适配器

中被正确对齐。关闭托盘门。以一定角度向托盘右侧施加压力。

5.4.5.6开始运行反应板：在7500Software中，选择Instrument→InstrumentMaintenanceManager。

在InstrumentMaintenanceManager中，选择RNaseP选项卡。在RNaseP屏幕，单击StartRNasePRun。

5.4.5.7依照向导的指示，完成校准。RNaseP对话框显示四个选项卡：

?Overview–显示校准相关信息。

?Setup–显示RNaseP运行设置说明。单击Next提醒可以开启Run选项卡。

?Run–单击STARTRUN可以开始运行流程并显示处理消息。单击Next提醒可以开启Analysis选项卡。

?Analysis–指明运行状态(Passed/Failed)。

注：开始运行之前，仪器可能暂停（最长10分钟），以允许受热的护盖达到正确温度。注：7500Software完成RNaseP运行后，会自动分析运行，并在Analysis屏幕显示结果。

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5.4.5.8在RNasePRun向导的Analysis屏幕上，确认运行状态：

?Passed–7500InstrumentRNaseP运行通过。转到步骤5.4.5.12。

?Failed–7500InstrumentRNaseP运行失败。请转至步骤5.4.5.9复查数据以查找异常值。若运行失败，则自动分析中可能已包括了导致初始分析失败的异常值。试验性错误可能会导致某些反应孔扩增不充分或根本不扩增。这些孔寻常产生和相关复本孔的平均值差异很大的CT值。假使在计算中包括这些偏差值（异常值），则会得出错误的测量结果。

5.4.5.9在AmplificationPlot中，从PlotType下拉列表中选择Ctvs.Well。

5.4.5.10通过比较CT值的分组，确认反应板上每个重复组（对照品、标准品和未知重复组）的均一性。

①在反应板布局中，选择含有10,000份未知重复组的反应孔（反应孔F、G和H行）：

②在图中，确认重复组的CT等同。

注：图谱X轴上的数字，对应于反应板的反应孔。从反应孔A1开始，反应孔从左至右、从上至下编号。

③若所选组中出现一个异常值，则选择反应板布局中的相应反应孔，然后单击Omit以从分析中除去该反应孔。（重要！假使异常值的数量超过前表中的限制，订购另一个RNaseP反应板，然后重复试验。）

可除去的最多反应孔个数仪器未知重复组5000份7500610000份6标准物（STD）0阴性对照（NC）0④为反应板上的每个重复组（未知重复组、标准物和阴性对照）重复步骤5.4.5.10①至5.4.5.10③。

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5.4.5.11单击Reanalyze，在不使用异常值的状况下分析运行。若执行步骤5.4.5.9至5.4.5.11后，RNase

P运行的状态为Failed，请用另一不同的RNaseP反应板重复RNaseP试验。假使问题仍旧存在，请生产商联系。

5.4.5.12查看标准曲线：

①选择StandardCurve（标准曲线）选项卡。②单击PlateLayout的左上角以选择所有反应孔。③确认R2值大于或等于0.990。

若R2值小于0.990，请用另一不同的RNaseP反应板重复RNaseP试验。假使问题仍旧存在，请生产商联系。

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5.4.5.13单击Next，然后移除校准反应板。（注意！灼热。仪器工作期间，样本块温度可能超过100°C。

若刚使用过仪器，在样本块恢复至室温之前，请勿触摸样本块。）①按压托盘门，将其开启。②取出校准反应板。

③按压托盘门，使其滑入仪器。

5.4.5.14丢弃反应板。

5.4.5.15单击Finish，当提醒保存试验时单击Yes