免疫共沉淀实验原理及方式

免疫共沉淀实验原理及方式免疫共沉淀（CoIP）概述及原理（Co-Immunoprecipitation,CoIP）是研究蛋白-蛋白间彼此作用的经典方式，属于的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而能够用于鉴定那个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点能够归纳为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质彼此作用技术（如GST-Pulldown、酵母双杂交等）相较，免疫共沉淀鉴定的彼此作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，幸免了人为的阻碍，因此符合体内实际情形，取得的蛋白可信度更高。免疫共沉淀的局限性和注意事项：免疫共沉淀是成立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分极可能检测不到；由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能致使利用某一种pull-down抗体，不管怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好利用多种不同抗体别离进行CoIP；由于检测的是天然状态，因此在不同的时刻和不同的处置下,CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，固然随实在验次数的增加，取得的蛋白复合物成员也会愈来愈庞大；若是利用WesternBlot的方式检测的蛋白复合物中的目标蛋白，那么需要在实验前进行预测，具有必然的冒险性；固然若是将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要取得较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，而且本钱较高；CoIP鉴定取得的蛋白间彼此作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pulldown等实验检测；为了保证CoIP实验的靠得住性和严谨性，需要利用复合物的不同成员别离独立进行CoIP实验，而且结果应该能够彼此验证，因为原那么上利用复合物的任一成员进行CoIP都会取得其他所有成员免疫共沉淀的一样操作流程（中英文对照）：CqIILysateorProteinMixtureIncubsuanwithAntibndy-caupledResin=%. AntibodyAntigenProteinlirteractingwith朗咖nAnalyze1.用预冷的PBS洗涤细胞两次;Carefullywashculturedcellswithpre-chilledPBSfor2times.加入预冷的RIPA裂解缓冲液(107细胞加入1ml)；AddincoldRIPAlysisbuffer(1mlfor107cells).用预冷的细胞刮将细胞从培育介质上刮离，并转移到干净的管中。并置于低速摇床，4°C缓慢晃动15min；Scrapcellsofftocleaneppendorftubeswithaclean,coldscraper.Putthemonalow-speedrotatingshakerfor15minat4°C.4C,14000g离心15min,当即将上清转移到一个新的离心管中Centrifugeat14,000g4°Cfor15min,transferthesupernatanttonewtubesimmediately.将ProteinA/G-agarose微球用PBS洗两遍,用PBS配制成50%的proteinA/G-agarose工作液；WashproteinA/G-agarosebeadsfor2timeswithPBSandmakea50%proteinA/Gagaroseworkingsolution(inPBS)在样品中以每1ml中加100pl的比例，加入50%的ProteinA/Gagarose工作液。水平摇床4°C摇动10min(该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白)Addin50%proteinA/Gagarosewithratioof100plfora1mlsamplesolution.Shakeonhorizontalshakerfor10min,4°C(Thisstepaimstoeliminatenon-specificbindingproteins)4°C,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中，去除proteinA/G-agraose微球；Centrifuge14,000gat4°Cfor15min,transferthesupernatanttonewtubesanddiscardproteinA/G-agraosebeads利用BCA法或其他方式测定总蛋白的浓度QuantifytotalproteinwithBCAassayorothermethods.用PBS将总蛋白稀释到1pg/pl以降低裂解液中去垢剂的浓度。若是你感觉你的目的蛋白的浓度低了，你能够将总蛋白浓度提高到10pg/pl(假设浓度够的话)Dilutethetotalproteinto1pg/plwithPBStodeclinetheconcentrationsofdetergents.Ifyoufeeltheconcentrationofyourtargetproteinislow,youcandilutethetotalproteinto10pg/pl.(ifit'shighenough)加入必然体积的一抗，至整体积约为500pl；inappropriateamountofprimaryantibodytoapproximately500pltotalvolume.用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4C留宿Slowlyshakeantigen-antibodycomplexonrotatingshakerat4°Cforovernight.注意:若是若是下游用于激酶或磷酸酶的酶活测定，那么最好将11步改成室温孵育2h；Note:ifdownstreamexperimentisenzymeactivityassayforkinaseorphosphatase,it'sbettertochangestep11toa2hincubationatroomtemperature.14000g离心5s,搜集沉淀，而且用预冷的洗涤缓冲液（或预冷的PBS）洗涤3遍（每次加入800|jl）Centrifuge14,000gfor5s,keepthepelletandwashwithpre-chilledwashingbuffer（orcoldPBS）for3times.（800pleach）（用适合体积的上样缓冲液重悬）搜集上清，用于进一步的下游SDS，western-blot或质谱分析CollectthesupernatanttoproceedtoSDS,western-blot,ormassspectraanalysis.注意：该CoIP操作步骤是将抗体先结合到ProteinA/G-argarose微球上，然后再与抗原混合。相对其他方式，最终的得率较低，但幸免了抗体共洗脱的问题。若是你希望取得高纯度的目的蛋白，而不考虑非特异性结合的话，你能够将抗体和蛋白样品在加入ProteinA/G-argarose微球之前进行混合，如此最后抗体也会和目的蛋白一同被洗脱下来，从而可能会对westernblot检测造成干扰。Note:ThisCo-IPprotocolistobindantibodytotheProteinA/G-argarosebeadsandthenmixwiththeantigen.Itgiveslesseryieldthantheotheroneandavoidstheproblemofco-elutionofantibodies.Ifyouwanttoyieldhighpurityoftargetproteinregardlessofnon-specificbinding,youcanmixantibodywithprotei