第七章植物原生质体培养技术

第七章植物原生 的用 特点：脆弱，容易受到外界机械刺激成、细胞膜成、细胞膜结构、大分子物质进出细胞机理等问题 原 是 的良好受体。与外 DNA（如质粒）共存时，原 可以 任何植物都可以通过原 实现 GFP=绿色荧光蛋甜橙原 转 PCR分

Southernblot分 原生可以进行细胞融合。由于原生质体没有细胞壁的阻碍，原生之间可以 第二节的酶解法是大 高质量原 主要方法原理：植物细胞壁主要由纤维素、半纤维 和果胶质组成，利用纤维素酶、半纤维素 游离出来 优点：效率高，用少量的材料就可以得到 /g 量完整的原 。杨树：~7,000,000原/g一、植物材料的选择一、植物材料的选择要求 能力和再生能力强的植物材料，无 酶解液准酶解液中一般含有纤维素酶、半纤维素酶和在配酶解液时可以用原生 培养基作溶解 CaCl22H2OMgSO47HSO45H27.2101.0148.0246.00.160.025CPW=Cell- stWash 为了保持原的完整及为了保持原 使原 处于一个等渗环境中。因此， 解液中必须加入渗透压调节剂，使其水势常用的渗透压调节剂有甘露醇或山常用的渗透压调节剂有甘露醇或山 一般在25±2℃、中酶解，期间轻摇动几次，或放在50rpm的摇。酶解时间长，原生产量高，但时间过长会影响原生的培养效果。三、原 的收集与纯 过滤：酶解结束后，将酶解物通过孔径为离心与洗涤：滤液转到离心管中在50×g下5min。然后弃去上清液，用含甘露醇 的培养基或CPW液重新悬浮沉淀的原 3. 纯化 将21%蔗糖溶液加入底部，进行 心，完整的原生 漂浮在蔗糖溶液与原生质体溶液的交界处，死细胞及碎片沉入蔗糖溶液 5.收集原 四、原 的测 分离过分离过程的高低对后来的原生培养和融合影响极大。原 的每个步骤都会影响到原 ， 此，必须十分步 （FDA）染色法 原生（%）=（FDA）染色法 原生（%）=发荧光的原生 数/原总数×100Fluorescein

完整、有 第三节原生 第三节原生如何培养原 ——激素（一、原生的与植株再在适宜的培养条件下，原生可见原生由圆球形逐渐变为方形、多边约1-数天后：原生开始发生第一次；以后：随着细胞次数增多，原生成细胞团，进一步分化出 MS+5MS+5M2,4-植板率34.7%atday密度：25000 MS+10μMor1μM 6688 特点——操作简单，对原 的损伤小特点——容易更新培养基和转移培养物 原 之间粘连、不能判断细胞团的归属原（平板培养 35℃左右的琼脂或琼脂糖培养基与原生溶液混 液体—固体结合培 含原 的液体培养固固体培养（1）液体浅层—固体平板培养双层培养法： 体、未凝固的琼脂糖培养基，滴在培养皿中，待其凝固后，再加入适量的液体培养优点：改进了培养物的通气和营养环境，从而促进可以促进原生的及细胞团的形成 一植物不同的品种1.植物材料：用于分离原生 一植物不同的品种 诱导出愈伤 再生了 料 材料容易料2.2.（1）基本培养基：不同植物原生要求有不同的基本培养基。使用什么基本培养基，可以参照相应培养愈伤组织或细胞的培养基。一般认为，原生培养基种的大量元素应比愈伤组织培养基中的大量元素浓度低。由于Ca2+影响到膜的稳定性，因此较高Ca2+浓度的对原生 有利。培养原生时要求培养基有更丰富的有机成分，如氨基酸（特别是谷氨酰胺）、维生素、椰子水，水解酪蛋白，水解乳蛋白，小牛等。激素：培养基中要加入一定浓度的素和生长素。由于2,4-D 促进细胞能力很强，所以培养基中大都加2,4-D大促进原生的和细胞团的形成。 第三节融合与体细胞第三节由于没有细胞壁的限制，原生可以彼此的原生发生融合，则可以实现加倍。原 融 st两个不同植物的原 发生融合=体细胞杂交(somatichybridization)体细胞杂交克服了有性生殖，使不同种、属间、科间植物的大规模遗传物质转移、重组成为可株，甚至创造出神奇的超级植物，如番茄-马铃薯、体细胞杂交包括4个过程——原 的分离与处理——原 的诱导融合——杂种细胞的选择和植株再生——杂种植株的鉴定对称体细胞杂交—两个完整的原生发生融合不对称体细胞杂交—两个不完整的原生发生融细胞核失活：用X射线、γ射线、碘乙酸、碘乙酰胺 原 A 原生

诱导诱导混合，保持混多次多次洗调节密度，培养，植株再杂杂种植株选择与鉴二、原 的融 化学诱导法是利用一些化学物质，如NaNO3、聚乙二醇（polyethyleneglycol,原理：消除原 表面的电荷，促进 最常用的是聚乙二醇法和高钙高pH(1)聚乙二醇法聚乙二醇（PEG）是高分子的(1)聚乙二醇法聚乙二醇（PEG）是高分子的有机PEG诱导融合剂一般用0.01molL-1CaCl2·2H2O溶液配制，PEG浓度为30%-可以用高温高压法灭菌，可以在4℃下保存(２)高钙高pH高钙高pH法的诱导剂为CaCl26H9甘露pH过 ，随用随 在离心管中分别将2种植物的原 调至相密度（~5×105个/ml），向原 混合液中加入等体积的诱导融合 离心（50-100×g,10min），弃上清液，用培养基 （４）重复（３）3-４次，最后用培养基将原生质化学诱导融优点：试剂便宜，成本低化学诱导融优点：试剂便宜，成本低缺点：操作比较烦琐（反复离心、悬 （二）物理方法（电融合 交流电诱导薄荷原 融 表观差异：根据2种植物原 的显著观差异，找出中间类型的细胞。如正常绿 选择标记：抗性（抗生素、除草剂）标、营养互补标记等 四、再生植株的鉴 杂种细胞中双亲遗传物质运： —一个或者两个细胞的不同程度丢