分子生物学导论分子生物学研究方法3

（优选）分子生物学导论分子生物学研究方法现在是1页\一共有66页\编辑于星期四1第七节 核酸序列分析技术一、Sanger双脱氧链终止法二、Maxam-GilbertDNA化学降解法三、DNA序列测定的自动化四、DNA杂交测序法五、基因芯片测序六、最新测序技术现在是2页\一共有66页\编辑于星期四2现在是3页\一共有66页\编辑于星期四3原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来一、Sanger双脱氧链终止法

现在是4页\一共有66页\编辑于星期四4过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。

该法亦适合mRNA的序列分析。

GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。现在是5页\一共有66页\编辑于星期四5ATGCGGTACCAT5’3’测序模板5’5’5’5’5’5’5’5’5’

5’5’5’四套反应体系1--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP

TATACGCCATACGCCATGGTATACTACGCTACGCCTACGTACGCCATGTACGCCATGGTTACGCCATTACGCCATGGT2--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4--dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTP现在是6页\一共有66页\编辑于星期四6双脱氧法的特点需要单链模板、寡核苷酸引物和高质量的DNA聚合酶。缺点：（1）聚合反应会因二级结构而提前终止，常常测不到准确的DNA序列；（2）由于经模板与引物结合后才能反应并测序，因此对于寡聚核苷酸DNA序列（例如对引物DNA的序列）不能测定；（3）该法直接分析的是合成的新链序列，而不是模板链，因此不能分析模板中甲基化部位；（4）需要适当的引物和能合成单链模板的载体。优点：简单、快速。现在是7页\一共有66页\编辑于星期四7二、Maxam-GilbertDNA化学降解法基本步骤:(1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P)；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开；(5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。现在是8页\一共有66页\编辑于星期四8化学测序法的优点：（1）待测的DNA序列来自原有的DNA分子，因此可以分析DNA被修饰的碱基；（2）测序反应不受DNA二级结构的影响；（3）不需要将待测序的DNA亚克隆到其他载体上，不需要通过通用的引物；（4）可测定较短的DNA序列。化学测序法的缺点：（1）待测DNA需要进行末端放射性标记、变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析，操作较复杂；（2）该方法测序范围约为250bp，稍低于双脱氧法；（3）本方法主要限制因素是变性聚丙酰烯胺凝胶电泳分离分析分辨能力比较低。

现在是9页\一共有66页\编辑于星期四9三、DNA序列测定的自动化

1.DNA测序步骤与自动化1）模板制备：可自动化2）定序反应：可自动化3）凝胶电泳：自动化有一定困难，制胶、点样、电泳、凝胶干燥、放射自显影。4）核苷酸序列阅读与计算机输入：可自动化

DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一是指“分析反应”的自动化，另一方面则是指“读片过程”的自动化。现在是10页\一共有66页\编辑于星期四102.自动测序仪

Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP）黑色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP）

绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP）

兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）现在是11页\一共有66页\编辑于星期四11现在是12页\一共有66页\编辑于星期四12现在是13页\一共有66页\编辑于星期四13优点:(1)四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间；(2)可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影；(3)可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。缺点：无法保留原始记录,四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰,导致读序时分辨率下降。现在是14页\一共有66页\编辑于星期四14四、DNA杂交测序法自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencingbyhybridization，SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤：

首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，

然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。现在是15页\一共有66页\编辑于星期四15如果将一种核苷酸顺序为5'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。现在是16页\一共有66页\编辑于星期四16上图是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。现在是17页\一共有66页\编辑于星期四17五、基因芯片测序现在是18页\一共有66页\编辑于星期四18基因芯片测序流程现在是19页\一共有66页\编辑于星期四19六、最新测序技术1.新一代测序技术（Nextgenerationsequencingtechnology）美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪美国Illumina公司英国Solexatechnology公司合作开发的Illumina测序仪美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪Dover/Harvard公司的Polonator测序仪美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪

所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-arraysequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。现在是20页\一共有66页\编辑于星期四20焦磷酸测序边合成边测序

边连接边测序3730xlSanger双脱氧核苷酸新一代测序技术的发展为基因组学研究带来了更大的机遇现在是21页\一共有66页\编辑于星期四21现在是22页\一共有66页\编辑于星期四22几种新一代测序仪的比较现在是23页\一共有66页\编辑于星期四23新一代测序技术的应用现在是24页\一共有66页\编辑于星期四242.第三代测序技术（Thirdgenerationsequencingtechnology）英国牛津纳米孔公司——基于纳米孔的单分子读取技术。该技术在测序时DNA分子依靠核酸外切酶一次一个碱基地通过小孔，无需多次扩增和荧光标记。现在是25页\一共有66页\编辑于星期四25第八节 转基因技术一、植物基因转化载体系统的构建二、受体材料的选择三、植物遗传转化体系四、转化体的筛选和鉴定现在是26页\一共有66页\编辑于星期四26蓝色妖姬，转基因蓝玫瑰？现在是27页\一共有66页\编辑于星期四27现在是28页\一共有66页\编辑于星期四28适宜外植体的选择及再生体系的建立抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择遗传转化操作载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法选择培养转基因植株鉴定获得再生植株转化质粒的构建转基因植株的繁殖与应用利用报告基因Southern杂交Northern杂交Western杂交植物遗传转化流程现在是29页\一共有66页\编辑于星期四291.一元载体系统一元载体系统是中间表达载体与改造后的受体Ti质粒通过同源重组所产生的一种复合型载体，通常又称为共整合载体。一、植物基因转化载体系统的构建现在是30页\一共有66页\编辑于星期四302.双元载体系统双元载体系统是指两个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统，由于其T-DNA和Vir区在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故又称为反式载体。一元载体(顺式载体)双元载体(反式载体)现在是31页\一共有66页\编辑于星期四31二、受体材料的选择受体是指用于接受外源DNA的转化材料。良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：1.高效稳定的再生能力；2.受体材料要有较高的遗传稳定性；3.外植体来源方便，如胚和其它器官等；4.对筛选剂敏感；5.转化率高。现在是32页\一共有66页\编辑于星期四32常用的受体材料有以下几大类型:1.愈伤组织再生系统外植体材料经过脱分化培养诱导形成愈伤组织，转化(带有目的基因质粒的农杆菌侵染)，分化培养获得再生植株。优点：外植体来源广，繁殖快，易接受外源基因，转化效率高。缺点：遗传稳定性差、嵌合体因此需要连续的再生系统现在是33页\一共有66页\编辑于星期四332.直接分化再生系统

外植体材料细胞不经过脱分化形成愈伤组织阶段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。优点：周期短、操作简单，体细胞变异小，遗传稳定；缺点：材料局限，转化率低。现在是34页\一共有66页\编辑于星期四343.原生质体再生系统原生质体恢复细胞壁具有分化再生能力，是应用最早的再生受体系统之一。优点：高效、广泛地摄取外源DNA或遗传物质，获得基因型一致的克隆细胞，所获转基因植株嵌合体少，适用于多种转化系统；缺点：不易制备、再生困难和变异程度高。现在是35页\一共有66页\编辑于星期四354.胚状体再生系统是指具有胚胎性质的个体。优点：个体数目巨大、同质性好，接受外源基因能力强，嵌合体少，易于培养、再生。缺点：技术含量高，多数植物不易获得胚状体。现在是36页\一共有66页\编辑于星期四365.生殖细胞受体系统以生殖细胞如花粉粒、卵细胞等受体细胞进行外源基因转化的系统。一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统；二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。现在是37页\一共有66页\编辑于星期四37三、植物遗传转化体系（一）载体型遗传转化系统最常见的转基因方法。将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。农杆菌Ti质粒（tumor-inducingplasmid）或Ri质粒(root-indcing

plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。现在是38页\一共有66页\编辑于星期四38农杆菌共培养侵染诱导愈伤组织分化生芽生根叶盘转化法(1)叶盘法

双子叶植物较为常用、简单有效的方法。现在是39页\一共有66页\编辑于星期四39(2)真空渗入法将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。该法简便、快速、可靠，不需要组织培养。(3)愈伤组织共培养(4)原生质体共培养现在是40页\一共有66页\编辑于星期四40（二）DNA直接转化系统1.化学刺激法细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）转化顺利，对细胞伤害小；避免嵌合体的生成；易于选择；便于进行理论研究；受体广泛。

优点：现在是41页\一共有66页\编辑于星期四41将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。步骤简单易行：适合于大多数细胞或组织，克服了受体材料的限制，不必制备原生质体，具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。2.基因枪轰击法（微弹轰击技术micro-projectilebombardment)

现在是42页\一共有66页\编辑于星期四423.高压电穿孔法电击法＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－利用高压脉冲作用，在原生质体上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的摄取。现在是43页\一共有66页\编辑于星期四434.微注射法

细胞操作：利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。子房注射法或花粉管通道法：具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。现在是44页\一共有66页\编辑于星期四44四、转化体的筛选和鉴定1.转化体的筛选外源目的基因转化频率低目的基因已被整合到核基因组并表达转化细胞更少使用特异性选择标记基因（selectablemarkergenes）进行标记，有效地选择出真正转化细胞。常用选择标记基因：抗生素抗性基因；除草剂抗性基因将选择标记基因与适当启动子构成嵌合基因，克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。标记基因在受体细胞表达，使转化细胞具有抵抗相应抗生素或除草剂的能力而存活下来。非转化细胞则被抑制、杀死。现在是45页\一共有66页\编辑于星期四452.转化体的鉴定（1）DNA水平的鉴定（2）转录水平的鉴定（3）翻译水平的鉴定现在是46页\一共有66页\编辑于星期四46第九节 RNAi技术RNA干扰（RNAinterference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。一、RNAi的发现1995年，康乃尔大学的Guo等秀丽新小杆线虫(C.elegans)现在是47页\一共有66页\编辑于星期四47二、RNA干扰的作用机制现在是48页\一共有66页\编辑于星期四48基因敲除又叫基因打靶，通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。完全基因敲除条件型基因敲除第十节基因敲除技术(geneknock-out)现在是49页\一共有66页\编辑于星期四49现在是50页\一共有66页\编辑于星期四50第十节 蛋白组学及其研究技术一、蛋白质组学的研究内容二、蛋白质组学的研究技术1.免疫组织化学技术2.双向电泳技术3.生物质谱技术4.酵母双杂交和噬菌体展示技术5.芯片技术6.凝胶阻滞电泳（EMSA）7.DNaseI足迹法现在是51页\一共有66页\编辑于星期四51mRNA经翻译产生蛋白质，一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称为蛋白质组(proteome)蛋白质组学(proteomics)是1994年澳大利亚学者Wilkins和Williams提出的。蛋白组学(proteomics)旨在阐明生物体全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括鉴定蛋白质的表达、存在方式、结构、功能和相互作用等。现在是52页\一共有66页\编辑于星期四52一、蛋白质组学的研究内容1.蛋白质鉴定2.翻译后修饰3.蛋白质功能确定4.医学应用现在是53页\一共有66页\编辑于星期四53二、蛋白质组学的研究技术蛋白质组学分为结构蛋白质组学和功能蛋白质组学两大类。前者主要研究蛋白质氨基酸序列及三维结构、种类分析和数量确定；后者主要研究蛋白质的功能和相互作用。现在是54页\一共有66页\编辑于星期四54（一）免疫组织化学技术现在是55页\一共有66页\编辑于星期四55（二）双向电泳技术现在是56页\一共有66页\编辑于星期四56（三）生物质谱技术现在是57页\一共有66页\编辑于星期四57现在是58页\一共有66页\编辑于星期四58（四）酵母双杂交和噬菌体展示技术现在是59页\一共有66页\编辑于星期四59（五）芯片技术现在是60页\一共有66页\编辑