大肠杆菌基因工程

大肠杆菌基因工程第1页，共62页，2023年，2月20日，星期四基因工程课程内容5

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基因工程概论分子克隆单元操作大肠杆菌基因工程酵母基因工程动物基因工程植物基因工程基因工程进展第2页，共62页，2023年，2月20日，星期四回顾：基因工程的基本目的是什么？1、获取、整理遗传信息资源：破解生命之谜、利用基因资源2、生产功能蛋白或化学原料研究用途：基因功能研究，工具酶、免疫分析用抗原/抗体医药用途：蛋白/多肽药物、抗原（疫苗）、抗体（治疗/诊断）、免疫毒素等。

工业用途：工业用酶、工业原料3、改良生物性状：分子育种（改良/创造）、基因治疗/免疫

第3页，共62页，2023年，2月20日，星期四问题：如何利用基因资源？克隆目的基因转入特定宿主表达目的基因生产蛋白/多肽：强调高效分子育种/基因治疗/免疫：强调可控全基因：基因文库/PCR编码序列：cDNA文库/RT-PCR/合成选择宿主（特点、优缺点？）构建表达载体（关键元件、调控原理？）转基因（转化系统、导入方法？）第4页，共62页，2023年，2月20日，星期四基因工程主要宿主系统

原核细胞(Prokaryotic)真菌（Fungus)

昆虫(Baculovirus)

高等真核细胞（Eukaryotic)人（基因治疗）动、植物（基因农场）第5页，共62页，2023年，2月20日，星期四主要的蛋白质生产宿主系统I原核：大肠杆菌Escherichiacoli*****

枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis**

II低等真核：酿酒酵母Saccharomycescerevisiae

毕赤酵母Pichiapastoris***汉森酵母Hansenulapolymopha**

黑曲霉菌Aspergillusniger

**

III高等真核：

中国仓鼠细胞（CHO）***

昆虫细胞——杆状病毒**重点：各自优缺点是什么？第6页，共62页，2023年，2月20日，星期四表达载体的基本条件（关键元件）1、高效的、可调控的表达元件

1）转录与转录后水平：DNAmRNA原核：启动子、终止子真核：启动子、终止子、增强子、PolyA位点、内含子2）

翻译水平原核：核糖体结合位点（如SD序列）真核：5’-端非翻译区（5’-UTR）3)翻译后水平:信号肽重点：各宿主系统表达载体的关键元件、调控原理与优化策略？第7页，共62页，2023年，2月20日，星期四表达载体的基本条件（关键元件）

3、便于筛选大肠杆菌中的筛选标记（表达载体构建）

最终宿主系统的筛选标记（转基因宿主筛选）4、便于目的基因亚克隆：多克隆位点2、高拷贝数与遗传稳定

自主复制（高拷贝、不稳定）

整合（低拷贝、稳定）第8页，共62页，2023年，2月20日，星期四典型的原核表达载体第9页，共62页，2023年，2月20日，星期四典型的原核表达载体第10页，共62页，2023年，2月20日，星期四典型的真核表达载体第11页，共62页，2023年，2月20日，星期四第三章大肠杆菌基因工程Escherichiacoli

（SEM，×14000）

第12页，共62页，2023年，2月20日，星期四四、工程菌构建、分析、发酵与产物分离纯化三、工程菌构建策略二、大肠杆菌表达系统高效表达原理一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点五、利用大肠杆菌系统生产重组蛋白案例第三章大肠杆菌基因工程第13页，共62页，2023年，2月20日，星期四一、大肠杆菌表达系统的优缺点第14页，共62页，2023年，2月20日，星期四原核细胞与真核细胞的差别第15页，共62页，2023年，2月20日，星期四生长速度惊人的大肠杆菌第16页，共62页，2023年，2月20日，星期四遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作表达水平高，遗传较稳定

优良的工业性能：繁殖迅速、培养简单、操作方便、被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统大肠杆菌表达系统的优点第17页，共62页，2023年，2月20日，星期四胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）细胞周质内含有种类繁多的内毒素大肠杆菌表达系统的缺点第18页，共62页，2023年，2月20日，星期四

初次尝试扫盲乱棍打枣入门系统优化中级自成一体高手成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸第19页，共62页，2023年，2月20日，星期四二、大肠杆菌系统高效表达原理启动子（转录）终止子（转录）核糖体结合位点（翻译）密码子（翻译）质粒拷贝数（转录）第20页，共62页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌系统表达载体的基本元件A、目的基因：编码外源蛋白的结构基因B、转录元件：启动子、终止子C、翻译元件：核糖体结合位点、翻译起始位点D、克隆元件：克隆位点、复制原点、标记基因E、翻译后元件（非必须）：信号肽、融合肽第21页，共62页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌系统表达载体的物理图谱第22页，共62页，2023年，2月20日，星期四1、启动子与外源基因表达

*是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始RNA合成的序列。*是基因表达最关键调控元件（没有启动子，基因就不能转录）。*启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效）*有组成型和诱导型二大类启动子(Promoter)第23页，共62页，2023年，2月20日，星期四组成型与诱导型启动子*无需诱导*整个生长过程一直不停地表达目的蛋白*一般采用基础代谢关键酶基因的启动子*不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白产物*表达量通常不高：过量或者有害表达影响细菌生长组成型表达系统第24页，共62页，2023年，2月20日，星期四组成型与诱导型启动子*只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物*使生长相与表达相分开，避免表达与生长争营养和对菌体的毒害*可减少菌体蛋白酶对目标产物的降解*特别适合解决有毒蛋白的表达*启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。诱导型表达系统第25页，共62页，2023年，2月20日，星期四原核基因启动子原核生物启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：

（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。

（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。第26页，共62页，2023年，2月20日，星期四启动子保守序列-35区序列-10区序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac启动子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac

=

3

Ptrp

=

11

PlacPtac

=

3

Ptrp

=

11

Plac第27页，共62页，2023年，2月20日，星期四启动子的筛选AprorigalKpKO1终止子采用鸟枪法策略，将合适大小的DNA片段克隆到启动子探针质粒pKO1上宿主细胞染色体DNA上的galE、galT与质粒上报告基因galk的表达产物联合作用，可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株含有外源启动子活性的重组克隆第28页，共62页，2023年，2月20日，星期四常用原核基因启动子

lac(乳糖启动子)trp(色氨酸启动子)tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子PL和PR(λ噬菌体的左向和右向启动子)T7启动子第29页，共62页，2023年，2月20日，星期四启动子P乳糖启动子（Plac）负调控（lacI）：OPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高第30页，共62页，2023年，2月20日，星期四P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高lacI负调控转录受CAP正调控和lacI负调控第31页，共62页，2023年，2月20日，星期四P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控第32页，共62页，2023年，2月20日，星期四P乳糖启动子PlacOPO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基高水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控第33页，共62页，2023年，2月20日，星期四P乳糖启动子PlacO高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac与其控制区Olac偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基底水平表达；诱导物可以使启动子Plac介导的转录大幅提高转录受CAP正调控和lacI负调控lacI负调控第34页，共62页，2023年，2月20日，星期四问题1：葡萄糖是宿主最适碳源，而启动子受葡萄糖阻遏，不便于发酵培养基设计

对策：采用突变型PlacUV5（不受葡萄糖阻遏）Plac

-lacI调控模式的问题与策略第35页，共62页，2023年，2月20日，星期四PlacCAP正调控OPlacO高效转录葡萄糖代谢野生型的Plac上游附近拥有代谢激活蛋白（CAP）结合区，cAMP激活CAP，CAP基底水平转录结合启动子控制区，进而促进Plac介导的转录。葡萄糖代谢使cAMP减少，也能阻遏Plac介导的转录。因此，可采用突变手段构建抗葡萄糖代谢阻遏的突变型，即PlacUV5CAPcAMPcAMP浓度降低PlacUV5O高效转录突变型乳糖启动子PlacUV5第36页，共62页，2023年，2月20日，星期四问题2乳糖容易被宿主菌利用和降解，不宜作为诱导剂对策采用“安慰诱导剂”IPTG（不被降解和代谢）Plac

-lacI调控模式的问题与策略IPTG：异丙基D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside)第37页，共62页，2023年，2月20日，星期四问题3：宿主lacI阻遏蛋白表达量不高，无法满足多拷贝质粒的需求，导致较高的本底表达（即无诱导表达）

对策

A、采用能过量表达lacI阻遏蛋白的lacIq

突变菌株

B、在

载体上引入lacIq

基因Plac

-lacI调控模式的问题与策略第38页，共62页，2023年，2月20日，星期四启动子Ptrp色氨酸启动子（Ptrp）Otrp除去色氨酸色氨酸启动子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白复合物的阻遏，转录呈基底状态。在培养系统中去除色氨酸基底水平转录或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的细菌培养体系中，除去色氨酸是困难的，因此基因工程中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目基因的表达色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效转录阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效转录OtrpPtrp第39页，共62页，2023年，2月20日，星期四受lacI阻遏蛋白调控杂合型启动子PtacPtac

=

Ptrp

的-35区+

Plac的-10区Ptac=

3

Ptrp

=

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Plac（TTGACA）（TATAAT）受什么诱导？第40页，共62页，2023年，2月20日，星期四l噬菌体启动子PL/PR受CI阻遏蛋白阻遏CI为组成型表达常采用温度敏感型突变cI857cI857阻遏蛋在42℃时失活脱落，PL便可介导目的基因的表达实践中，28-37℃培养，42℃诱导。30℃/37℃？第41页，共62页，2023年，2月20日，星期四发酵罐中大规模升温困难如何解决？常使Ptrp控制的CI用一个双质粒控制系统，用色氨酸间接控制目的基因表达（不是加3-吲哚丙烯酸，IAA）。PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表达色氨酸第42页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子——来自T7噬菌体的异源启动子第43页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子——最成功的启动子

*只有T7RNA聚合酶才能识别T7启动子*T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶的快5倍*由于大肠杆菌本身不含T7RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌。*通过调控T7RNA聚合酶的表达间接调控外源基因的表达*以Novagen公司的pET系统为杰出代表。第44页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子调控模式

IPTG诱导T7RNA聚合酶表达噬菌体DE3（lambda噬菌体的衍生株）含有lacI抑制基因和位于lacUV5启动子下的T7RNA聚合酶基因。DE3溶源化的菌株如BL21(DE3)就是最常用的表达菌株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导调控方式和lac一样都是IPTG诱导。第45页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子调控模式

2.热诱导T7RNA聚合酶用不含T7RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，用λCE6噬菌体侵染宿主细胞——CE6是lambda噬菌体含温度敏感突变(cI857ts)和pL/pR启动子控制T7RNA聚合酶的衍生株，在热诱导条件下可以激活T7RNA聚合酶的合成。第46页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子调控模式

3.溶氧诱导T7RNA聚合酶通过共转化质粒提供T7RNA聚合酶。用受溶氧浓度控制的启动子调控T7RNA聚合酶合成，以适合工业化发酵的条件控制。第47页，共62页，2023年，2月20日，星期四T7启动子调控模式

4.抑制本底表达方法

1）培养基外加葡萄糖，有助于控制本底表达水平。2)向宿主细胞引入T7融菌酶质粒（pLysS），结合并抑制T7RNA聚合酶的基因。第48页，共62页，2023年，2月20日，星期四2、终止子外源基因本身的转录效率下降；干扰质粒的复制及抗性，导致重组质粒的不稳定性；产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源基因编码产物的翻译效率。转录过头现象：RNA聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物。第49页，共62页，2023年，2月20日，星期四防止转录过头策略

大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2T7噬菌体DNA上的TfA、采用强终止子B、二聚体终止子串联的特殊结构第50页，共62页，2023年，2月20日，星期四终止子强终止子的选择与使用

目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组DNA中克隆筛选pCP1AproriTcr筛选Apr、Tcs的转化子第51页，共62页，2023年，2月20日，星期四3、核糖体结合位点核糖体结合位点（RBS）:

mRNA5’

端非翻译序列,包括SD、起始密码子、SD与起始密码子间的序列、起始密码子下游序列。

商品化大肠杆菌表达质粒均含有与启动子来源相同的RBS，序列和间隔是最佳的

第52页，共62页，2023年，2月20日，星期四核糖体结合位点SD序列（Shine-Dalgarno）：

位于翻译起始密码子上游的6-8个核苷酸序列（5’UAAGGAGG3’），它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的16SrRNA3’端区域3’AUUCCUCC5’并与之专一性结合，将mRNA定位于核糖体上，从而启动翻译。第53页，共62页，2023年，2月20日，星期四核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的距离的影响：

SD序列与起始密码子之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子AUG正好处于核糖体复合物结构中的P位，这是翻译启动的前提条件。

在很多情况下，SD序列位于AUG之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低第54页，共62页，2023年，2月20日，星期四核糖体结合位点SD序列与起始密码子之间的序列的影响：

SD序列下游的碱基若为AAAA或UUUU，翻译效率最高；而CCCC或GGGG的翻译效率则分别是最高值的50%和25%。紧邻AUG的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌b-半乳糖苷酶的mRNA而言，在这个位置上最佳的碱基组合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或AGG取代之，则酶的表达水平低20倍第55页，共62页，2023年，2月20日，星期四核糖体结合位点翻译起始密码子及其下游序列大肠杆菌绝大部分基因以AUG作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用GUG或UUG作为翻译起始密码子。

起始效率差异：GUG为AUG的50%而UUG只及AUG的25%。从AUG开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与mRNA的5’端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰mRNA在核糖体上的准确定位。

第56页，共62页，2023年，2月20日，星期四4、质粒拷贝数质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响目前实验室里广泛使用的克隆用质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

策略：较低拷贝质粒（几个至数十个）

调