基因工程原理重组基因导入受体细胞

基因工程原理重组基因导入受体细胞第1页，共97页，2023年，2月20日，星期四基因工程原理PrincipleofGeneEngineering

第五章基因工程原理第五章第2页，共97页，2023年，2月20日，星期四DNA重组（限制性内切酶）运输工具——基因克隆载体目的基因的制备目的基因导入受体细胞外源基因的表达基因工程的应用第3页，共97页，2023年，2月20日，星期四第五章重组基因导入受体细胞第4页，共97页，2023年，2月20日，星期四第一节受体细胞受体细胞（receptorcell），又称宿主细胞或寄主细胞，是能够摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞。受体细胞的选择应符合以下原则：①便于重组DNA分子的导入②能使重组DNA分子稳定存在于细胞中③便于重组体的筛选④遗传稳定性高⑤安全性高⑥内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低⑦遗传密码无明显偏倚性⑧具有较好的转移后加工机制第5页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.原核受体细胞较为理想的受体细胞：大部分没有细胞壁，便于外源DNA进入没有核膜，染色体DNA没有固定结合的蛋白质基因组简单，不含线粒体、质体多为单细胞，容易获得一致性材料，易于扩大培养或发酵生长常用细菌：大肠杆菌。第6页，共97页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌。特点：G-,单个细胞，0.5μm*(1~3)μm，周身鞭毛、能运动、无芽孢。例：胰岛素、生长素、干扰素、RE……优点：完善成熟的受体系统。缺点：毒素等，折叠加工问题第7页，共97页，2023年，2月20日，星期四酵母菌表达系统的优势：结构最为简单的真核生物之一，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单培养简单遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长安全性高，无致病性，不会对外界环境造成污染具有较好的转译后加工机制，便于真核生物表达2.酵母受体细胞第8页，共97页，2023年，2月20日，星期四3.植物受体细胞优点：真核细胞、细胞的全能性。4.动物细胞受体细胞包括：小鼠BHK细胞、中国仓鼠卵巢细胞CHO，猴肾细胞等受体动物：鼠、牛、羊、鱼等第9页，共97页，2023年，2月20日，星期四第二节重组基因导入受体细胞一、重组基因导入原核受体细胞接受DNA片段第10页，共97页，2023年，2月20日，星期四转化（transformation）——重组质粒DNA分子进入受体细胞，并在受体细胞稳定维持和表达的过程，转化后的受体菌，称转化子。（一）转化1928年英国学者F·Griffth在肺炎双球菌中发现的，证明了遗传的物质基础是DNA。转化率＝转化子DNA分子数转化子细胞数＝第11页，共97页，2023年，2月20日，星期四Ca2+诱导大肠杆菌转化法对数生长后期的菌体5x107个/毫升冰浴10分钟含CaCl2缓冲液15分钟含CaCl2缓冲液（1）感受态的制备（2）DNA分子转化感受态细胞（3）筛选转化子。Ca2+：低温下使磷质层形成液晶结构，使膜间核酸酶分离与DNA结合，抗DNase第12页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）转导是指通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞将外源DNA分子导入到受体细胞内并稳定遗传的过程。第13页，共97页，2023年，2月20日，星期四D突变E突变溶源菌培养诱导溶菌生长45℃15min39℃2-3h收集包装物λ噬菌体DNA噬菌体颗粒转导包装第14页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）转染是采用与质粒DNA转化受体细胞相似的方法，将重组λ噬菌体DNA分子直接导入受体细胞中的过程。第15页，共97页，2023年，2月20日，星期四（四）电激穿孔是利用高压电脉冲作用，在大肠杆菌细胞膜上进行电穿孔，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA的有效吸收。——1988年，DowerWJ等参数：电场强度电脉冲时间外源DNA浓度当50%～70%菌体细胞死亡时，转化率最高第16页，共97页，2023年，2月20日，星期四（五）三亲本杂交（triparentalmating）三亲本杂交结合转化法是基于非接合型质粒的迁移作用而建立的一种DNA转化方法。第17页，共97页，2023年，2月20日，星期四第18页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、重组基因导入植物受体细胞（一）土壤农杆菌介导的Ti质粒转化外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。第19页，共97页，2023年，2月20日，星期四（Vir区）（Con区）长度25kb，占Ti质粒1/10主要功能是转移DNA，随机插入植物染色体中。

——天然的质粒克隆载体。含有2类基因：（1）编码冠瘿碱合成酶（ocs、nos）及分解代谢的基因。（2）诱发肿瘤基因（Onc）Vir区：激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性。占Ti质粒1/3。Con区——调控Ti质粒在农杆菌之间的转移，含有与细菌间接合转移的有关基因tra。Ori区——复制起始区。第20页，共97页，2023年，2月20日，星期四限制性酶切开外源基因Ti质粒载体第21页，共97页，2023年，2月20日，星期四（1）叶盘法转化植物细胞第22页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）整体植株接种转化法人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，使农杆菌按照天然的感染过程在植株体内进行侵染。获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。第23页，共97页，2023年，2月20日，星期四（3）原生质体共培养转化法原生质体共培养转化法是以原生质体作为受体细胞，通过将根癌农杆菌与原生质体作短暂的共培养，然后洗涤除去残留的根癌农杆菌后，置于含抗生素的选择培养基上筛选出转化细胞，进而再生成植株。第24页，共97页，2023年，2月20日，星期四（4）悬浮细胞共培养转化法与原生质体共培养转化法相似第25页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）植物病毒介导基因转移植物病毒DNA病毒20%RNA病毒80%花椰菜花叶病毒：双链DNA病毒第26页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）化学诱导DNA直接转化（1）多聚物介导法聚乙二醇多聚赖氨酸多聚鸟苷酸第27页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）脂质体介导基因转化脂质体第28页，共97页，2023年，2月20日，星期四第29页，共97页，2023年，2月20日，星期四（四）物理方法介导DNA直接转化（1）基因枪转化第30页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）超声波介导转化（3）激光微束穿孔转化第31页，共97页，2023年，2月20日，星期四（4）显微注射第32页，共97页，2023年，2月20日，星期四第33页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、重组基因导入动物受体细胞（一）转染法第34页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）脂质体介导转化第35页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）动物病毒介导转导法第36页，共97页，2023年，2月20日，星期四第三节重组子筛选只有少数受体细胞能被导入重组DNA分子例：大肠杆菌108个大肠杆菌，转化效率10-6只有100个细胞被转化第37页，共97页，2023年，2月20日，星期四克隆子的筛选：经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选（Screening）或选择(Selection)。转化子：导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞。重组子：含有重组DNA分子的转化子。如果重组子含有外源目的基因，又称为阳性克隆子或期望重组子。第38页，共97页，2023年，2月20日，星期四一、遗传表型直接筛选（一）利用载体选择性标记筛选转化子抗药性标插入失活筛选插入表达筛选α－互补法（蓝白斑筛选法）（二）利用报告基因筛选植物转化细胞（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞（四）营养缺陷型检测法（五）形成噬菌斑筛选法第39页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、依赖于重组子结构特征分析筛选三、核酸杂交分析（一）分子探针：放射性探针、非放射性探针、标记探针的方法（二）核酸探针杂交分析四、免疫化学分析检测（一）抗体检测法（二）免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation,IP）（三）转译筛选法五、PCR筛选法第40页，共97页，2023年，2月20日，星期四一、遗传表型直接筛选（一）利用载体选择性标记筛选转化子1.抗药性标记氨苄青霉素氯霉素卡那霉素四环素链霉素第41页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.插入失活筛选第42页，共97页，2023年，2月20日，星期四3.插入表达筛选载体的选择性标记基因前链接一段附调控序列，插入式祸福调控序列后，其下游的筛选标记基因才能表达第43页，共97页，2023年，2月20日，星期四。IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷4.α－互补法（蓝白斑筛选法）乳糖操纵子：第44页，共97页，2023年，2月20日，星期四第45页，共97页，2023年，2月20日，星期四IPTGα-互补：是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。第46页，共97页，2023年，2月20日，星期四IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷显色剂：X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。第47页，共97页，2023年，2月20日，星期四第48页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）利用报告基因筛选植物转化细胞（1）新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因（2）潮霉素磷酸转移酶（HPT）基因（3）氯霉素乙酰基转移酶（CAT）基因（4）β—葡萄糖苷酶（GUS）基因（5）荧光素酶（LUC）基因（6）抗除草剂bar基因：抗草丁膦（7）冠瘿碱合成酶基因报告基因

(reportergene)——是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。第49页，共97页，2023年，2月20日，星期四荧光素酶（LUC）基因转入了萤火虫的荧光素酶基因能发光的烟草(1)萤光素+ATP→萤光素化腺苷酸（luciferyladenylate）+PPi(2)萤光素化腺苷酸+O2→氧萤光素

+AMP+光机理：第50页，共97页，2023年，2月20日，星期四GFP：绿色荧光蛋白日本科学家下村修（伍兹霍尔海洋生物学研究所）美国科学家马丁•查尔菲（哥伦比亚大学）钱永健（加利福尼亚大学圣迭戈分校）2008年诺贝尔化学奖：第51页，共97页，2023年，2月20日，星期四GFP标记的微管将绿黄红荧光蛋白质植入鱼的DNA分子结构中稳定表达表达GFP的CHO细胞GFP转基因小鼠第52页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞（1）胸苷激酶（TK）基因：（2）二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（3）黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（XGPRT）基因：胸苷（T）转换成TMP的基因催化二氢叶酸还原成四氢叶酸催化GMP生成第53页，共97页，2023年，2月20日，星期四（四）营养缺陷型检测法第54页，共97页，2023年，2月20日，星期四（五）形成噬菌斑筛选法第55页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、依赖于重组子结构特征分析筛选（一）快速裂解菌落鉴定分子大小：琼脂糖电泳，分析DNA分子大小（二）限制性核酸内切酶酶解分析：DNA酶切图谱（三）核酸杂交分析第56页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、核酸杂交分析基本原理：具有一定互补的两条核酸(DNA或RNA)单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。核酸杂交：两种不同来源单链DNA或RNA相互配对的过程。分子杂交：生物大分子之间通过相互作用结合在一起：核酸之间通过碱基互补配对；蛋白质之间通过抗原、抗体反应；核酸、蛋白质之间通过疏水作用，氢键进行相互作用。——1968年华盛顿卡内基学院RoyBritten等第57页，共97页，2023年，2月20日，星期四常见的分子杂交：Southernblotting：DNA，DNA/RNA

Northernblotting：RNA，DNA/RNA

Dot/slotblotting（斑点/狭缝杂交）insituhybridization：组织原位杂交Westernblotting：蛋白质/抗原、抗体待测分子探针第58页，共97页，2023年，2月20日，星期四（一）分子探针(Molecularprobe)：是指具有同特异性目标分子产生很强的相互作用并可对其相互作用的产物进行有效检测的DNA分子、RNA分子和蛋白质。1.放射性探针：32P、3H、35S、14C、125I第59页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.非放射性探针（1）生物素（biotin）标记探针：生物素与dUTP中尿嘧啶的5位C相连，在聚合酶作用参入DNAdUTPBiotin(维生素H，VH)连接臂第60页，共97页，2023年，2月20日，星期四（藻红素）（链霉亲和素）（生物素）第61页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）

地高辛标记探针：地高辛与UTP中尿嘧啶的C5相连dUTP连接臂地高辛地高辛：异羟基洋地黄毒苷，强心素，拉诺辛，Cardiox，Cardoxin，Cedoxin第62页，共97页，2023年，2月20日，星期四第63页，共97页，2023年，2月20日，星期四第64页，共97页，2023年，2月20日，星期四（3）

荧光素标记探针：用荧光素标记核酸、抗生物素蛋白或抗地高辛抗体。

荧光物质异硫氰酸荧光素（黄绿色）罗丹明（红色）羟基香豆素（兰色）第65页，共97页，2023年，2月20日，星期四3.标记探针的方法（1）切口平移标记法第66页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）随机引物标记法第67页，共97页，2023年，2月20日，星期四（3）末端标记法第68页，共97页，2023年，2月20日，星期四（4）PCR标记法第69页，共97页，2023年，2月20日，星期四（5）光敏标记法：光敏基团第70页，共97页，2023年，2月20日，星期四（6）化学衍生结合标记法：（7）交叉相连标记法：第71页，共97页，2023年，2月20日，星期四对重组体克隆进行筛选和鉴定的方法之一是利用核酸杂交法进行筛选，它包括Southern印记杂交法、Northern印记杂交、斑点印记杂交和（菌落原位杂交）杂交。各种杂交中需要对探针进行标记，其中对探针进行非放射性标记的常见标记物有（荧光素）、（生物素）、（地高辛）。标记探针的方法（切口平移标记法）、（随机引物标记法）、（末端标记法）、（PCR标记法）、（光敏标记法）、化学衍生结合标记法以及交叉相连标记法。在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是(a)(a)诱导宿主的α肽的合成(b)诱导宿主的ω肽的合成

(c)作为酶的作用底物(d)作为显色反应的指示剂第72页，共97页，2023年，2月20日，星期四α-互补筛选属于下列哪种筛选方法：(B)A.抗药性标志选择B.标志补救C.原位杂交法D.酶联免疫吸附E.分子杂交应用α-互补筛选重组体时，含有外源基因的重组体菌落颜色应为：(C)A.紫色B.蓝色C.白色（阻遏蛋白不能表达）D.无色E.以上都不是水母发光蛋白由236个氨基酸构成，其中Asp、Gly、Ser构成发光环，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（筛选标记）(C)A.促使目的基因导入宿主细胞中B.促使目的基因在宿主细胞中复制

C.使目的基因容易被检测出来D.使目的基因容易成功表达建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?第73页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）核酸探针杂交分析基本原理：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地退火形成双链。探针：用于检测的核苷酸片段。Southernblotting：DNA/DNA,RNA

Northernblotting：RNA/DNA,RNA

Dotblotting：DNA芯片

insituhybridization：组织原位杂交Westernblotting：蛋白质/抗原、抗体第74页，共97页，2023年，2月20日，星期四第75页，共97页，2023年，2月20日，星期四（1）Southern印迹杂交

1975年由英国人southern创建待测的核酸序列：DNA探针：DNA或RNA第76页，共97页，2023年，2月20日，星期四电转移方法：湿式电转移半干式电转移第77页，共97页，2023年，2月20日，星期四（2）Nouthern印迹杂交（1979年，J.C.Alwine等）待测的核酸序列：RNA探针：DNA或RNA第78页，共97页，2023年，2月20日，星期四（3）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交待测的核酸序列：DNA和RNA探针：DNA或RNA第79页，共97页，2023年，2月20日，星期四（4）菌落（噬菌斑）原位杂交

Grunstein和Hosness，1975年第80页，共97页，2023年，2月20日，星期四第81页，共97页，2023年，2月20日，星期四（5）荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH）用特定荧光素如生物素、地高辛等标记探针，与靶DNA进行杂交，通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，在荧光显微镜下观察探针标记或位点的技术。实验流程：FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析。第82页，共97页，2023年，2月20日，星期四

组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）简称原位杂交，指组织或细胞的原位杂交。是经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与DNA或RNA杂交，因此原位杂交可以确定探针互补序列在胞内的空间位置。（6）组织细胞的原位杂交第83页，共97页，2023年，2月20日，星期四（7）影响探针杂交的因素探针分子与目标分子之间序列的同一性探针的长度：<500b探针浓度杂交加速剂：硫酸葡聚糖杂交漂洗液的组成、反应温度、盐浓度第84页，共97页，2023年，2月20日，星期四四、免疫化学分析检测待测物：蛋白质探针：抗原、抗体抗体测定法免疫沉淀法分类第85页，共97页，2023年，2月20日，星期四（一）抗体检测法放射性抗体测定法非放射性抗体测定法分类第86页，共97页，2023年，2月20日，星期四1.放射性抗体测定Broome和Gilbert,1978年第87页，共97页，2023年，2月20日，星期四2.非放射性抗体测定第88页，共97页，2023年，2月20日，星期四第89页，共97页，2023年，2月20日，星期四（二）免疫沉淀测定法（Immunoprecipitation,IP）是一种研究蛋白质间交互作用的生物技术，这种技术是将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性，来进行研究。这项技术可用来将含有上千种不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质。第90页，共97页，2023年，2月20日，星期四（三）转译筛选法杂交抑制转译检测法杂交选择转译检测法无细胞翻译系统：没有完整细胞的体外蛋白质翻译合成系统。通常利用无细胞提取物提供所需要的核糖体、tRNA、酶类、氨基酸、能量供应系统及无机离子等，在试管中以外加的mRNA指导蛋白质的合成。常用的无细胞提取物有兔网织红细胞裂解物和麦胚抽提物等。第91页，共97页，2023年，2月20日，星期四无细胞翻译系统的作用：第92页，共97页，2023年，2月20日，星期四含重组子mRNA目的基因cDNA目的蛋白杂交抑