基因工程技术

基因工程技术第1页，共96页，2023年，2月20日，星期四第2页，共96页，2023年，2月20日，星期四第3页，共96页，2023年，2月20日，星期四◆基因工程相关概念◆基因工程相关的酶学◆基因工程的载体◆目的基因的制备和分离方法◆载体与目的基因的连接◆重组体的鉴定与分析◆隆基因的表达本章主要内容第4页，共96页，2023年，2月20日，星期四重组DNA技术的发展史年G.J.Mendel的豌豆杂交试验1944年O.T.Avery的肺炎球菌转化实验1973年美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年英国罗林研究所成功的克隆了多莉第5页，共96页，2023年，2月20日，星期四

一、基因工程技术相关概念

（一）DNA克隆

克隆（clone）：

来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。

克隆化（cloning）：

获取同一拷贝的过程，即无性繁殖。 分子克隆（DNA克隆） 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）第6页，共96页，2023年，2月20日，星期四第7页，共96页，2023年，2月20日，星期四第8页，共96页，2023年，2月20日，星期四第9页，共96页，2023年，2月20日，星期四

细胞的分化潜能

全能性(totipotency)一个细胞在一定条件下具有发育成完整个体的潜能，称为细胞的全能性(totipotency)。具有这种潜能的细胞称为全能性细胞。第10页，共96页，2023年，2月20日，星期四细胞核全能性第11页，共96页，2023年，2月20日，星期四第12页，共96页，2023年，2月20日，星期四DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。

第13页，共96页，2023年，2月20日，星期四

DNA克隆目的:①分离获得某一感兴趣的基因或DNA;②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）。第14页，共96页，2023年，2月20日，星期四

基因工程：

实现基因克隆所采用的方法及相关 的工作，又称为重组DNA技术(recom-binantDNAtechnology)。第15页，共96页，2023年，2月20日，星期四基因工程的基本过程和工作原理第16页，共96页，2023年，2月20日，星期四第17页，共96页，2023年，2月20日，星期四在这个过程中：

1.“基因剪刀”

剪取DNA的酶就像一把“基因剪刀”

2.“缝纫针”

连接不同来源DNA分子的酶就像一根“缝纫针”，使二者连在一起

3.“交通工具”使用载体好比一辆车子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比使乘客，车子把乘客送进理想天堂（宿主细胞）去繁衍生息，春华秋实，生产我们需要的产品或开展基因治疗（IL2/LAK→抗癌）。第18页，共96页，2023年，2月20日，星期四

（二）工具酶 限制性核酸内切酶

DNA聚合酶I

逆转录酶

DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶

TaqDNA聚合酶第19页，共96页，2023年，2月20日，星期四工具酶限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基常用的工具酶：第20页，共96页，2023年，2月20日，星期四一、限制性核酸内切酶

1.1概念识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。II类酶识别序列特点为回文结构。

第21页，共96页，2023年，2月20日，星期四第22页，共96页，2023年，2月20日，星期四1.限制性核酸内切酶1.2限制性核酸内切酶的命名Haemophilus

influenzaed

嗜血流感杆菌d株属名种名株名HindIII同一菌株中所含的多个不同的限制性内切酶第23页，共96页，2023年，2月20日，星期四

1.3基本特征：限制性核酸内切酶识别序列长度为4~8个bp。限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：

平头末端(flushend)和粘性末端(stickyend)第24页，共96页，2023年，2月20日，星期四

粘性末端

5´-端突出3´-端突出限制性核酸内切酶第25页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶第26页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶第27页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶第28页，共96页，2023年，2月20日，星期四同裂酶（isoschizomer），是来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同。

同尾酶（isocaudarner），一类识别不同核苷酸序列但能切割产生相同末端的限制性内切酶，一般是指能产生相同粘性末端的限制酶。同尾酶产生的相同粘性末端称配伍末端（compatibleend），可用连接酶连接。如SalI与XhoI，BamHI与BglII。第29页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶（1）消化作用：限制性内切酶以同源二聚体的形式与靶DNA序列发生作用识别，靶DNA的大小决定产生特定DNA片段的大小。（2）片段化：单酶切：n(环状）或n+1（线性）1.4限制性内切酶的对DNA的消化作用及其片段化第30页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶双酶切：a+b(环状），a+b+1(线性）（1）对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：酶切位点太靠近时，先用一种酶切，然后再用另一种酶切1.4限制性内切酶的对DNA的消化作用及其片段化第31页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶（1）不同的DNA片段通过互补的粘性末端连接称为分子间连接。（2）同一片段的2个互补末端之间的连接称为分子内连接1.5、具有粘性末端的DNA片段的两种连接方式。第32页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶(1)DNA样品的纯度：蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等。加大酶的用量，1μgDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间1.6影响限制性内切酶活性的因素第33页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶(2)DNA样品的甲基化程度：基因工程常常使用丢失了甲基化酶的大肠杆菌来制备质粒大肠杆菌的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclI、MboI等，但BamHI、BglII、Sau3AI不受影响。大肠杆菌的dcm甲基化酶在5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等哺乳动物的甲基化酶在5’CG3’序列中的C5位上引入甲基。影响酶切反应的因素第34页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶(3)底物DNA分子的构型：底物DNA不同构型对核酸限制性内切酶活性有较大的影响。(4)反应的温度：大多数为37℃

影响酶切反应的因素第35页，共96页，2023年，2月20日，星期四限制性核酸内切酶(5)反应体系的组成：缓冲液的种类，pH值，高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、添加二巯基丙醇，二二硫苏糖醇（DTT），BSADMSO等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Staractivity现象。

EcoRI在正常条件下识别并切割5’GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5’PuPuATPyPy3’或5’AATT3’。(6)酶量、反应体积、酶切时间合理使用。影响酶切反应的因素第36页，共96页，2023年，2月20日，星期四二、DNA连接酶

定义：可以催化具有5’-磷酰基和3’羟基末端形成磷酸二酯酶键的酶。第37页，共96页，2023年，2月20日，星期四二、DNA连接酶

（1）催化双链DNA上缺口处的磷酸二酯键形成2.1催化的反应第38页，共96页，2023年，2月20日，星期四二、DNA连接酶2.1催化的反应（2）催化RNA-DNA双链中的DNA链缺口处的磷酸二酯键形成第39页，共96页，2023年，2月20日，星期四二、DNA连接酶（3）连接多个平头双链DNA分子：2.1催化的反应第40页，共96页，2023年，2月20日，星期四三、聚合酶作用：以RNA或DNA为模板催化RNA或DNA的合成第41页，共96页，2023年，2月20日，星期四1.DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)三、聚合酶323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶/枯草杆菌蛋白水解酶DNA-polⅠ第42页，共96页，2023年，2月20日，星期四在模板和引物(DNA或RNA)存在的条件下，以dNTP作底物，沿5'→3'方向合成与模板互补的DNA。能够用于M13双脱氧法测序。5’→3’DNAPolymerase活性

第43页，共96页，2023年，2月20日，星期四单链特异性的3'→5'外切核酸酶活性第44页，共96页，2023年，2月20日，星期四修补经限制性酶消化dsDNA得到的3’隐蔽末端，使其成为平头末端。

使用随机引物进行DNA标记在cDNA的克隆中用于cDNA第二链的合成双脱氧法DNA序列测定(Sanger法)。用途第45页，共96页，2023年，2月20日，星期四第46页，共96页，2023年，2月20日，星期四随机引物DNA标记步骤第47页，共96页，2023年，2月20日，星期四1.来源源于T4噬菌体感染的E.coli。2.酶的活性，相似于Klenow片段，但远远强于Klenow片段（1）5ˊ→3ˊ

聚合活性（2）3ˊ→5ˊ

外切酶活性（T4pol/Klenow）3.基因工程中用途与Klenow片段一致（参前，标记末端，填平5’末端），不同的是可对3’突出端的DNA分子进行标记。这是用其强劲的3ˊ→5ˊ外切酶活性切除3’突出端，产生3’凹端。

2.T4-DNA聚合酶

第48页，共96页，2023年，2月20日，星期四T4-DNA聚合酶

第49页，共96页，2023年，2月20日，星期四T4-DNA聚合酶

第50页，共96页，2023年，2月20日，星期四3.TaqDNA聚合酶(TaqDNApol，Taqpol）

该酶是一种耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶，具有5’－3’聚合活性以及依赖5’－3’聚合酶作用的外切酶活性，聚合酶的最适反应温度是75℃－80℃,37℃活性有10％。该酶的主要用途是进行PCR反应（详参聚合酶链，polymerasechainreaction）

第51页，共96页，2023年，2月20日，星期四逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性：1.逆转录活性：即以RNA为模板合成DNA2.RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA3.DNApol活性：以DNA为模板合成DNA特点：无外切酶活性，转录错误率高2×10-4。4.逆转录酶3.DNApol活性：以DNA为模板合成DNA特点：无外切酶活性，转录错误率高2×10-4。2.RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA3.DNApol活性：以DNA为模板合成DNA特点：无外切酶活性，转录错误率高2×10-4。第52页，共96页，2023年，2月20日，星期四5’3’5’3’TTTTpolyAtail3’5’CCC3’5’3’GGG5’逆转录活性RNase活性RNA:DNA杂合链RNA模板单链DNA双链DNADNApol活性第53页，共96页，2023年，2月20日，星期四一种无需模板的DNA聚合酶，催化脱氧核苷酸结合到DNA分子的3’羟基端。带有突出、凹陷或平滑末端的单双链DNA分子均可作为TdT的底物。用途：催化DNA的3'末端添加同聚物DNA的3‘末端标记

给载体或cDNA加上互补的同聚尾，造成人工粘液末端可以重组。1.末端转移酶(TerminalTransferase，TdT)

四、DNA和RNA的修饰酶第54页，共96页，2023年，2月20日，星期四能催化除去DNA的5′磷酸基团，5’-P变为5’-OH；处理后的DNA片段缺少连接酶所要求的5′磷酸末端，因此它们不能进行自连接。可以在克隆时降低载体DNA的背景。小牛肠碱性磷酸酶(CalfIntestinal，CIP)

和细菌碱性磷酸酶（bacteriaIntestinalBIP)2.碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase）

四、DNA和RNA的修饰酶第55页，共96页，2023年，2月20日，星期四来源：米曲霉功能：降解ssDNA或RNA，形成5’磷酸末端的单或寡核苷酸。并且对DNA底物的活性比对RNA强。第56页，共96页，2023年，2月20日，星期四（1）内切单链DNA或RNA基本反应

五、核酸酶

单链核酸内切酶:S1核酸酶第57页，共96页，2023年，2月20日，星期四单链核酸内切酶:S1核酸酶（2）内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA基本反应第58页，共96页，2023年，2月20日，星期四S1核酸酶重要用途：S1作图（S1mapping）是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法。双链DNA变性后，与mRNA杂交，外显子区段与mRNA杂交形成双链，而DNA的其余部分仍为单链分子。通过电泳，确定不被降解的DNA片段的大小，即可确定mRNA的末端以及位于基因内部的内含子的位置。

S1mapping应用：①研究RNA的一级结构

②在已知基因的序列后测定mRNA起点和终点

③还可以检测前体RNA-mRNA的剪接点第59页，共96页，2023年，2月20日，星期四S1核酸酶作图第60页，共96页，2023年，2月20日，星期四第三节：基因工程的载体（vector）定义：是指用来携带外源目的基因、实现外源DNA克隆或/和表达蛋白质的DNA分子。

常用的载体： 质粒、噬菌体DNA、病毒DNA第61页，共96页，2023年，2月20日，星期四能自主复制，并目的基因的插入不影响其复制能力；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；3.含有不影响生长和复制的非必要区域，可以与外源DNA连接重组。4.具有两个以上的遗传标记物，便于重组体筛选和鉴定；5.分子量小，以容纳较大的外源DNA。载体的选择标准第62页，共96页，2023年，2月20日，星期四来源分类：质粒载体噬菌体载体病毒载体人工染色体载体用途分类：克隆载体表达载体穿梭载体常用载体:第63页，共96页，2023年，2月20日，星期四克隆载体(cloningvector)能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。表达载体(expressionvector)

使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。第64页，共96页，2023年，2月20日，星期四这类载体中含有来源不同的复制子结构，即具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,所以能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达．穿梭载体（shuttlevector)第65页，共96页，2023年，2月20日，星期四

1.质粒（plasmid）质粒是生物细胞内能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。常见于原核细菌和真菌中。绝大多数的天然DNA质粒具有共价、封闭、环状的分子结构，即cccDNA。大小约为1-300kb。第66页，共96页，2023年，2月20日，星期四质粒（plasmid）1.1质粒的构建天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：

pSC101：

8.8kb,拷贝数5,四环素抗性标记基因TcrColE1：6.5kb，拷贝数20-30大肠杆菌内毒素标记基因E1RSF2124：

ColE1衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因

Apr第67页，共96页，2023年，2月20日，星期四质粒（plasmid）1.2分类人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：高拷贝质粒：突变拷贝数控制基因，拷贝数1千-3千，便于扩增基因低拷贝质粒：来自pSC101，拷贝数小于10，表达某些毒性基因温敏质粒：在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质测序质粒：含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker整合质粒：装有整合促进基因及位点，便于外源基因的整合穿梭质粒：装有针对两种不同受体的复制起点，便于基因克隆表达质粒：装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件探针质粒：装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选第68页，共96页，2023年，2月20日，星期四质粒（plasmid）1.3重要的大肠杆菌质粒第69页，共96页，2023年，2月20日，星期四质粒（plasmid）重要的大肠杆菌质粒第70页，共96页，2023年，2月20日，星期四细菌人工染色体（BAC）

（具体见人工载体）第71页，共96页，2023年，2月20日，星期四λ噬菌体DNA第72页，共96页，2023年，2月20日，星期四第73页，共96页，2023年，2月20日，星期四λ噬菌体DNA第74页，共96页，2023年，2月20日，星期四λ噬菌体DNA第75页，共96页，2023年，2月20日，星期四λ噬菌体作为构建克隆载体的依据λ噬菌体是一种温和的噬菌体，对大肠杆菌具有较大的感染性。能承载较大的外源DNA片段在λ噬菌体分子上有多种限制性内切酶的位点第76页，共96页，2023年，2月20日，星期四λDNA载体的构建λ-DNA载体的构建：缩短长度，提高装载量。

野生型λ-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，插入的外源DNA片段不大于2.5kb。λ-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的，可切除。根据切除的多少，可将λ-DNA分成两大类载体：

插入型载体取代型载体第77页，共96页，2023年，2月20日，星期四λDNA载体的构建插入型载体：适用于cDNA的克隆和小片段DNA的克隆，含有插入失活的基因片段。如β-半乳糖苷酶。第78页，共96页，2023年，2月20日，星期四λDNA载体的构建取代型载体：具有多个限制性内切酶的位点，酶切后，除去当中的非必需成分，由外源DNA取代，才能形成噬菌斑。第79页，共96页，2023年，2月20日，星期四λDNA载体的特点λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌；λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量；重组λ-DNA分子的筛选较为方便；重组λ-DNA分子的提取较为简便；λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。第80页，共96页，2023年，2月20日，星期四即粘粒，带有cos位点的质粒（cossite-carryingplasmid）,是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型载体。1.8kb的λ-DNA片段+pBR322片段。装载范围为31-45kb。粘尾质粒（cosmid）第81页，共96页，2023年，2月20日，星期四能像λ-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞；能像质粒那样在受体细胞中自主复制；重组操作简便，筛选容易；加入特异启动子T3T7SP6，利于双向表达；装载量大（45kb），且克隆片段具有一定的大小范围；接上能够在真核细胞生活的元件，则可以在真核细胞表达。cosmid的优点第82页，共96页，2023年，2月20日，星期四M13单链噬菌体DNA

外型呈丝状由外壳包装蛋白和正链DNA组成DNA全长6407个核苷酸DNA上至少有10个基因不裂解宿主细胞，但抑制其生长3.1大肠杆菌M13噬菌体的结构2700个蛋白分子第83页，共96页，2023年，2月20日，星期四2.2M13单链噬菌体DNA感染周期第84页，共96页，2023年，2月20日，星期四M13单链噬菌体DNAM13DNA载体的构建第85页，共96页，2023年，2月20日，星期四M13单链噬菌体DNA使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细外,在DNA定向突变中非常有用；M13重组分子筛选简便；被M13噬菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大；但M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。M13DNA载体的特点第86页，共96页，2023年，2月20日，星期四λ-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和1.

5kb。但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段。考斯质粒和噬菌粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。第87页，共96页，2023年，2月20日，星期四六、真核细胞载体（一）哺乳动物细胞的病毒载体(二）酵母载体（三）杆状病毒载体第88页，共96页，2023年，2月20日，星期四人工染色体（artificialchromosome）载体

人类、动植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb的DNA片段，考斯质粒和噬菌粒载体的装载量远不能满足需要。将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人工染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。第89页，共96页，2023年，2月20日，星期四常用的人造染色体载体：

细菌人工染色体（BAC）；酵母人工染色体（YAC）;P1人工染色体（P1-derivedarti