基因工程基本操作技术

基因工程基本操作技术第1页，共79页，2023年，2月20日，星期四第一节离心技术离心技术基本原理离心机主要构造和类型离心技术应用第2页，共79页，2023年，2月20日，星期四生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离。

沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，己得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要配置各种类型的离心机。第3页，共79页，2023年，2月20日，星期四一、基本原理当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：a----粒子旋转的加速度m----沉降粒子的有效质量ω---粒子旋转的角速度r----粒子的旋转半径(cm)第4页，共79页，2023年，2月20日，星期四

∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2rrpm---revolutionsperminute为每分钟转数,r/min低速离心时常以转速“rpm”来表示高速离心时则以“g”表示第5页，共79页，2023年，2月20日，星期四将离心机转数换算为相对离心力时，首先，在r标尺上取已知的半径和在N标尺上取已知的离心机转数。然后，将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点极为相应的相对离心力数值。注意，若已知的转数值处于N标尺的右边，则应读取RCF标尺右边的数值；同样，转数值处于N标尺的左边，则读取RCF标尺左边的数值．第6页，共79页，2023年，2月20日，星期四二、离心机的主要构造和类型

实验用离心机

制备性离心机分析性离心机

工业用离心机离心机第7页，共79页，2023年，2月20日，星期四1、制备性离心机可分为三类离心机一般有离心主机，转头和离心管三部分组成。（1）普通离心机：最大转速6000rpm左右（2）高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min）（3）超速离心机：转速可达50000～80000rpm，装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。第8页，共79页，2023年，2月20日，星期四第9页，共79页，2023年，2月20日，星期四分析性离心机

分析性离心机使用了特殊设计的转头和光学检测系统，以便连续地监测物质在一个离心场中的沉降过程，从而确定其物理性质。

第10页，共79页，2023年，2月20日，星期四2、转头(1)角式转头

第11页，共79页，2023年，2月20日，星期四角式转子的特点：

（1）重心低,转速可较高

（2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的直径;

（3）“管壁效应”：

有一定的角度,在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀,此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。

第12页，共79页，2023年，2月20日，星期四(2)水平转子（1）转子静止时,处在转子中的离心管中

心线与旋转轴平行,

（2）转子旋转加速时,离心管中心线由

行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋

转轴成90°角,

（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本一致有少量的“管壁效应”水平转子的特点：

（1）转子的重心位置较高

（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径

（3）对于多种成分样品分离特别有效

（4）常用于速率区带离心和等密度离心第13页，共79页，2023年，2月20日，星期四第14页，共79页，2023年，2月20日，星期四第15页，共79页，2023年，2月20日，星期四

(3)区带转头：

区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。

(4)垂直转头：其离心管是垂直放置的。

(5)连续流动转头：

转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。第16页，共79页，2023年，2月20日，星期四3、离心管

塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。第17页，共79页，2023年，2月20日，星期四第18页，共79页，2023年，2月20日，星期四离心操作的注意事项使用各种离心机时，必须事先在天平上精确

平衡离心管和其内容物，转头中绝对不能装

载单数的管子。当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。离心过程中不得随意离开。第19页，共79页，2023年，2月20日，星期四装载溶液时，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。第20页，共79页，2023年，2月20日，星期四第21页，共79页，2023年，2月20日，星期四

根据离心原理,按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分为：三、离心分离方法沉降速度法：根据粒子大小、形状不同进行分离。差速离心法

速率区带离心法沉降平衡法

等密度离心法：又称等比重离心法,依粒子密度差进行分离,等密度离心法和上述速率区带离心法合称为密度梯度离心法。经典式沉降法：用于对生物大分子分子量的测定、纯度估计、构象变化。

第22页，共79页，2023年，2月20日，星期四用差速离心法分离已破碎的细胞各组份500g,10分钟上清液沉淀(细胞核）已破碎的细胞

10,000g,10分钟沉淀(细胞膜碎片,线粒体,溶酶体)100,000g,3小时上清液沉淀(核糖核蛋白体）

上清液(可溶性成份)

第23页，共79页，2023年，2月20日，星期四常用的梯度材料：

1.糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原

2.无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等

3.有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等

4.硅溶胶:如Percoll。

5.蛋白质:如牛血清白蛋白

6.重水

7.非水溶性有机物:如氟代碳等

等密度离心法第24页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.测定生物大分子的相对分子重量

沉降速度

沉降平衡

接近沉降平衡

2.生物大分子的纯度估计

3.分析生物大分子中的构象变化

分析性超速离心的应用第25页，共79页，2023年，2月20日，星期四第26页，共79页，2023年，2月20日，星期四第二节核酸的提取、纯化与含量测定第27页，共79页，2023年，2月20日，星期四就基因工程而言，核酸分子是其研究所涉及的主要对象，所以核酸的分离与提取是研究中很重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关系到实验的成败。第28页，共79页，2023年，2月20日，星期四核酸的分类DNA:主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA:存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。第29页，共79页，2023年，2月20日，星期四一、核酸提取的基本原理1、提取的含义:

提取是指在一定的条件下用一定的溶剂处理样品，使欲分离的物质充分释放到溶剂中的过程,又称为抽提。常用的溶剂有水、稀盐、稀酸、稀碱或甘油等较缓和的试剂。2、影响提取的主要因素:(1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。

(2)温度:一般温度升高溶解度增大

(3)溶液的粘度；

(4)扩散速度；

(5)扩散面积。第30页，共79页，2023年，2月20日，星期四二、核酸提取的原理

在生物体内核酸多以核蛋白的形式存在于组织中，根据核糖核蛋白(RNP)和脱氧核糖核蛋白(DNP)在不同浓度电解质溶液中溶解度明显差别进行分离。故用0.14mol/LNaCl溶解提取核糖核蛋白。核蛋白0.14mol/LNaCl1.0mol/LNaClRNP溶解度大溶解度小DNP溶解度小（仅为水中1%）溶解度大(比在水中大2倍)第31页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.核酸制备的一般原则(1)分离纯化核酸总的原则：①应保证核酸一级结构的完整性②排除其它分子的污染。第32页，共79页，2023年，2月20日，星期四(2)核酸纯化应达到的要求：核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②其它生物大分子的污染应降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染第33页，共79页，2023年，2月20日，星期四2.核酸制备时应注意的事项:

①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。②减少化学因素对核酸的降解。PH4-10③减少物理因素对核酸的降解。机械剪切力和高温④防止核酸的生物降解。第34页，共79页，2023年，2月20日，星期四3.核酸制备的一般方法和原理(1)核酸酶的抑制和抑制剂剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。第35页，共79页，2023年，2月20日，星期四DNase抑制①加入少量金属离子螯合剂，如0.01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。第36页，共79页，2023年，2月20日，星期四RNase抑制①操作要带手套。②所有器皿要严格消毒，③试剂处理④低温操作⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。

(TRZOL,DEPC,蛋白酶K)第37页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：①溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；②溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；③对RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠第38页，共79页，2023年，2月20日，星期四（3）核酸制备中常用的蛋白质变性剂蛋白质变性剂的作用：

①使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。②使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。③某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC（4）核酸制备中常用的酶制剂DNase、RNase、蛋白酶K、溶菌酶第39页，共79页，2023年，2月20日，星期四4、核酸提取的一般过程破碎细胞—提取--纯化（1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA，首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂第40页，共79页，2023年，2月20日，星期四（2）破碎抽提核酸除去杂质

①首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与其它成分分离

②使核酸与蛋白质分离③除去脂类

④多糖的除去第41页，共79页，2023年，2月20日，星期四5、核酸样品的保存

核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4℃（5℃）最佳和最简单

-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存

-20℃保存（冰箱的自动化霜装置）保存介质：

TE缓冲溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0第42页，共79页，2023年，2月20日，星期四三、DNA/RNA提取实例第43页，共79页，2023年，2月20日，星期四细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸1、植物DNA提取基本过程第44页，共79页，2023年，2月20日，星期四2、质粒DNA的提取方法方法：碱裂解法；煮沸裂解；羟基磷灰石柱层析法，质粒DNA释放法；酸酚法等。概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒DNA(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需)第45页，共79页，2023年，2月20日，星期四质粒DNA－碱裂解法碱裂解法原理染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。第46页，共79页，2023年，2月20日，星期四溶液I：50mM葡萄糖

10mMEDTApH8.025mMTris-HClpH8.010µg/mlRNaseA溶液II：0.2NNaOH1.0%SDS

以0.4NNaOH和2%SDS贮备液现用现配溶液III：5MKAc60ml

冰醋酸11.5ml

水28.5ml第47页，共79页，2023年，2月20日，星期四对数期菌体溶液III中和溶液I充分重悬溶液II裂解上清液抽提离心洗涤酒精沉淀干燥溶解沉淀质粒DNA溶液碱裂解法流程图第48页，共79页，2023年，2月20日，星期四3、细胞器DNA－差速离心法差速离心法原理是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。第49页，共79页，2023年，2月20日，星期四总结：DNA提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜－内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质

V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第50页，共79页，2023年，2月20日，星期四材料准备最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取质粒DNA的提取使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）第51页，共79页，2023年，2月20日，星期四细胞裂解材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高温温浴时，定时轻柔振荡基因组DNA的提取质粒DNA的提取菌体量适当培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染G＋菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁第52页，共79页，2023年，2月20日，星期四采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸分离、纯化第53页，共79页，2023年，2月20日，星期四蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离、纯化第54页，共79页，2023年，2月20日，星期四多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。核酸分离、纯化第55页，共79页，2023年，2月20日，星期四多酚的去除：在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤核酸分离、纯化第56页，共79页，2023年，2月20日，星期四当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解基因组DNA的提取质粒DNA的提取核酸沉淀、溶解第57页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质2.DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应3.DNA中残留有金属离子1.重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质2.重新沉淀DNA，让酒精充分挥发3.增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）4、DNA提取常见问题问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。

原因对策第58页，共79页，2023年，2月20日，星期四1.材料不新鲜或反复冻融2.未很好抑制内源核酸酶的活性3.提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4.外源核酸酶污染1.尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融2.液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液3.在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量4.细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔5.所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌6.将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融DNA提取常见问题问题二：DNA降解

原因对策第59页，共79页，2023年，2月20日，星期四实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少DNA提取常见问题

原因对策第60页，共79页，2023年，2月20日，星期四gDNA电泳图第61页，共79页，2023年，2月20日，星期四第62页，共79页，2023年，2月20日，星期四四、RNA提取第63页，共79页，2023年，2月20日，星期四RNA提取的通用方法异硫氰酸胍/苯酚法原理：细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。第64页，共79页，2023年，2月20日，星期四材料准备：尽量新鲜。裂解变性：异硫氰酸胍（亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物。洗涤：70％乙醇。沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。此外还常用氯化锂选择沉淀RNA。RNA提取的通用方法

步骤:第65页，共79页，2023年，2月20日，星期四影响RNA提取的因素材料：新鲜，切忌使用反复冻融的材料如若材料来源困难，且实验需要一定的时间间隔。可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存如要多次提取，请分成多份保存液氮长期保存，－70℃短期保存第66页，共79页，2023年，2月20日，星期四影响RNA提取的因素根据不同材料选择不同的处理方法：培养细胞：通常可直接加裂解液裂解酵母和细菌：一般TRIzol可直接裂解，对于一些特殊的材料可先用酶或者机械方法破壁动植物组织：先液氮研磨和匀浆，后加裂解液裂解。期间动作快速，样品保持冷冻样品量适当，保证充分裂解为减少DNA污染，可适当加大裂解液的用量

样品破碎及裂解：第67页，共79页，2023年，2月20日，星期四纯化：在使用氯仿抽提纯化时，一定要充分混匀，且动作快速；经典的纯化方法，如LiCl沉淀等，虽然经济，但操作时间长，易造成RNA降解；柱离心式纯化方法：抽提速度快，能有效去除影响RNA后续酶反应的杂质，是目前较为理想的选择。影响RNA提取的因素第68页，共79页，2023年，2月20日，星期四RNA提取常见问题RNA的降解

OD260/OD280比值偏低电泳带型异常下游实验效果不佳第69页，共79页，2023年，2月20日，星期四RNA降解

新鲜细胞或组织：裂解液的质量外源RNase的污染裂解液的用量不足组织裂解不充分另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。28S18S5S第70页，共79页，2023年，2月20日，星期四RNA降解冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70℃冰箱保存。样品要相对小一点；先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。第71页，共79页，2023年，2月20日，星期四OD260/OD280比值偏低

蛋白质污染：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。减少起始样品量，确保裂解完全、彻底解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。苯酚残留：不要吸入中间层及有机相，加入氯仿后首先混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。解决办法:重新抽提一次，再沉淀，溶解。第72页，共79页，2023年，2月20日，星期四OD260/OD280比值偏低抽提试剂残留：确保洗涤时要彻底悬浮RNA，