微生物计数的学习教案

微生物计数的学习教案第1页/共32页一、测定微生物数量的方法直接计数法（总菌计数法）

显微镜直接计数法间接计数法

稀释平板计数法（活菌计数法）液体稀释培养法比浊法浓缩法

第2页/共32页显微镜直接计数法

是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

细菌计数板（一般）--薄血球计数板（菌体较大）酵母菌\霉菌孢子--厚（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）

第3页/共32页直接计数法（总菌数测定法）显微镜直接计数法操作（视频）1、优点：所需设备简单，可迅速得到结果，能同时观察微生物形态特征；2、缺点：难以计数微小的细菌；难与区分死、活3、适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数第4页/共32页血球计数板是一块特制的厚载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个方格网。每个方格网共分9大格，其中间的一大格(又称为计数室)常被用作微生物的计数。血球计数板第5页/共32页计数室的刻度有两种：一种是大方格分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数室是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即每个大方格都由400个小方格组成。

第6页/共32页血球计数板A.正面图B.纵切面图

1.血球计数板2.盖玻片3.计数室第7页/共32页第8页/共32页16小格×25中格计数室

25小格×16中格计数室图5-2计数室的两种刻度形式第9页/共32页每个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，每个小方格的面积为1／400mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部之间的高度为0.1mm，所以每个计数室(大方格)的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为l／4000mm3。使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中微生物的数量，再换算成每毫升菌液(或每克样品)中微生物细胞的数量。

第10页/共32页已知：1毫升=1cm3=1000mm3１cm3体积应含有小方格数为1000mm3／（l／4000mm3）＝４X106第11页/共32页计数左上、左下、右上、右下左上、左下、右上、右下、中格（100小格）（80小格）16中格×25小格计数室25中格×16小格计数室第12页/共32页第13页/共32页l.菌悬液制备以无菌生理盐水制成浓度适当的菌悬液。每小格内约有3~5个菌体为宜。2.镜检计数室

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。3.加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。操作步骤第14页/共32页4.显微镜计数

加样后静止5min，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。位于中格双线上的菌体一般只数上方和左边线上的。如遇芽胞大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。5.清洗血细胞计数板

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。第15页/共32页1.有压线的菌体，计上不计下，计左不计右。出芽计一半。2.因菌液在血球计数板处于不同空间，要在不同焦距下才能看全，所以，观察时必须不断调细螺旋（调焦距长短），方可找全3.每个样品重复2—3次，若两次差别太大应重测五、注意事项第16页/共32页死、活细菌的区分第17页/共32页间接计数法

稀释平板计数法一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，进行菌落总数的测定，每ml(g)样品中的活菌数=（每皿菌落数平均值/取样体积）×稀释倍数第18页/共32页特点1、由于死亡的细菌不能繁殖成菌落，所以该法只计数活菌数；2、该法统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落；3、为使结果接近真实值，可将同一稀释度菌液加到三个或三个以上的平板上，计算菌落平均数。4、细菌、放线菌、酵母菌以每个培养皿内有30-300个菌落为宜；霉菌以每个培养皿10-100个为宜。第19页/共32页平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是，由于该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验(如活菌制剂)，以及食品、饮料和水(包括水源水)等的含菌指数或污染程度的检测第20页/共32页用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。第21页/共32页通常测定细菌菌剂含菌数时，10-7、10-8、10-9土壤细菌数量，采用10-4、10-5、10-6放线菌数量，采用l0-3、10-4、10-5真菌数量，采用10-2、10-3、10-4第22页/共32页

混合平板培养法

涂抹平板培养法。2．平板接种培养

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将无菌平板编上10-7、10-8、10-9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-9稀释液各1ml放入编号10-9的3个平板中，同法吸取10-8稀释液各lml放入编号10-8的3个平板中，再吸取10-7稀释液各lml放入编号10-7的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45—50℃的细菌培养基，轻轻转动平板(P112)，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。（1）混合平板培养法

第24页/共32页（2）涂抹平板计数法

涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设三个重复）。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20—30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。第25页/共32页基本操作一般包括：样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。第26页/共32页结果计算

计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。

(1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。（2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30—300个菌落为宜，霉菌以每皿10—100个菌落为宜。选择好计数的稀释度后，即可统计在平板上长出的菌落数，统计结果按下式计算。第27页/共32页每ml(g)样品中的活菌数=

（每皿菌落数平均值/取样体积）×稀释倍数混合平板计数法：每ml(g)样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数涂抹平板计效法：每ml(g)样品的菌数=同一稀释度几次重复的菌落平均数×10×稀释倍数第28页/共32页将实验结果填入下表中

第29页/共32页菌落计数规则：

（一）选择平均菌落数在30~300间的平板1、只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告；2、有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：若比值小，报告平均数；若比值