微生物的遗传和变异6学时

微生物的遗传和变异6学时第1页/共156页第一节微生物的遗传物质一、微生物的遗传物质二、微生物遗传信息的表达三、微生物基因表达的调控第2页/共156页一、微生物的遗传物质（一）证明核酸是遗传物质的经典实验（二）微生物的染色体基因组（三）微生物染色体外的遗传物质第3页/共156页（一）证明核酸是遗传物质的经典实验1、细菌的转化实验2、噬菌体感染实验3、病毒重建实验第4页/共156页1、细菌的转化实验细菌的转化实验：1928年，英国医生Griffith以肺炎链球菌

(Streptococcuspneumoniae)作为研究对象第5页/共156页1944年，Avery等人从热死的S型菌体中提纯了可能作为转化因子的各种成分，并在离体条件下进行了转化实验第6页/共156页2、噬菌体感染实验噬菌体感染实验：1952年，Hershey和Chase培养获得含32P-DNA的噬菌体和含35S-蛋白质的噬菌体；他们作了两组对E.coli的感染实验第7页/共156页3、病毒重建实验病毒重建实验：1956年，Fraenkel用TMV的RNA与HRV的蛋白质外壳重建后的杂合病毒去感染烟草时，烟叶上出现的是典型的TMV病斑第8页/共156页核酸是遗传物质以上三个实验的结论：只有核酸才是贮存遗传信息的真正物质细胞生物的遗传物质：双链DNA病毒的遗传物质：可以是单链的或双链的DNA或RNA第9页/共156页DNARNA碱基腺嘌呤(adennine,A)鸟嘌呤(guanine,G)胞嘧啶(cytosine,C)胸腺嘧啶(thymine,T)腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶(Uracil,U)戊糖脱氧核糖核糖磷酸磷酸磷酸核酸的化学组成第10页/共156页第11页/共156页第12页/共156页一、微生物的遗传物质（一）证明核酸是遗传物质的经典实验（二）微生物的染色体基因组（三）微生物染色体外的遗传物质第13页/共156页（二）微生物的染色体基因组染色体：微生物遗传物质DNA的主要存在形式；不同种类，其DNA的数目、大小、结构差异显著基因组（genome）：微生物单倍体的所有染色体及其所包含遗传基因的总称；包括编码蛋白质的结构基因、调控序列以及目前功能尚不清楚的DNA序列基因（gene）：是有功能的DNA片段，含有合成有功能的蛋白质多肽链或RNA所必需的全部核苷酸序列，是遗传的结构和功能单位第14页/共156页生物学名基因组大小（bp）基因数λ噬菌体λphage5×10450T4噬菌体T4phage2×105150大肠杆菌Escherichiacoli4.7×1064100枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis4.2×1064700啤酒酵母Saccharomycescerevisiae13.5×1065800脉孢菌Neurosporasp.6.0×1076000果蝇Drosophilamelanogaster

8×107

12000人human3×10950000第15页/共156页1、大肠杆菌的基因组染色体：只有一条，大小为4.7×106bp；双链、环状DNA，与类组蛋白等结合成致密的手脚架形基因的转录与翻译在细胞质耦合发生遗传信息具有连续性，一般不含内含子功能相关的结构基因组成操纵子（operon）结构基因的单拷贝重复序列少而短，一般为4~40个碱基第16页/共156页第17页/共156页第18页/共156页第19页/共156页2、啤酒酵母的基因组染色体：16条，总大小为13.5×106bp；染色体由核小体组成，其上有着丝粒和端粒；每一条染色体只含有一条线状、双链DNA基因的转录在细胞核内进行，而翻译则在细胞质的核糖体上发生高度重复：tRNA基因在每条染色体上至少有4个，共约250个拷贝没有明显的操纵子结构，有间隔区或内含子序列第20页/共156页第21页/共156页第22页/共156页原核微生物与真核生微物基因组的比较比较项目原核微生物真核微生物基因组大小小,106大,107-9染色体一般1条，环状多条，线状核小体无有基因连续性强弱（有内含子）重复序列和不编码序列少多操纵子结构普遍存在一般没有转录、转译部位同在细胞质中进行在核中转录，在细胞质中转译第23页/共156页3、λ噬菌体的基因组染色体：包装到二十面体头内，大小为48,502bp；dsDNA，线状许多功能相关的基因聚集成簇排列复制和裂解过程中．基因组程序性开启或关闭第24页/共156页第25页/共156页第26页/共156页一、微生物的遗传物质（一）证明核酸是遗传物质的经典实验（二）微生物的染色体基因组（三）微生物染色体外的遗传物质第27页/共156页（三）微生物染色体外的遗传物质1、细胞器DNA2、质粒3、转座因子第28页/共156页1、细胞器DNA细胞器DNA：真核微生物的叶绿体、线粒体等细胞器都有自己的独立于染色体的环状双链DNA编码自身所需要的与能量转换有关的蛋白质第29页/共156页第30页/共156页2、质粒质粒（plasma）：是宿主染色体外决定某些性状（如抗药性、接合作用等）的闭合、环状、双链DNA目前仅发现于原核微生物和酵母菌中第31页/共156页第32页/共156页质粒的特性常是共价闭合、环状、双链DNA分子具有自我复制能力不是宿主生长所必需的，消除质粒后不会影响到宿主细胞的生存决定宿主细胞的某些性状，如抗药性、接合作用等具有不相容性第33页/共156页第34页/共156页质粒在基因工程中的应用质粒的优点：体积小，易分离和操作；环状，稳定；独立复制；拷贝数多；存在标记位点，易筛选质粒的提取与检测：碱裂法提取；琼脂糖凝胶电泳检测第35页/共156页第36页/共156页3、转座因子转座因子：是微生物细胞中可在染色体上改变自身座位的一段DNA序列在原核微生物和真核微生物中都有存在第37页/共156页转座因子的类型插入序列（IS）：只含有编码转座所必需的转座酶基因，如IS4转座子（Tn）：包括复合转座子和复杂转座子两种类型转座噬菌体：具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体，如Mu第38页/共156页第39页/共156页第40页/共156页二、微生物遗传信息的表达（一）DNA的复制（二）基因的转录（三）多肽链的翻译第41页/共156页第42页/共156页（一）DNA的复制参与复制（replication）的物质：原料dNTP、模板DNA、DNA聚合酶、其他蛋白质因子复制方式：半保留复制，不连续复制复制起点：大多数细菌及病毒只有一个复制起点，一个复制子；真核生物是多起点的，多个复制子复制方向：大多数双向进行，方向为5’→3’复制的三个阶段：复制的起始、复制的延伸和复制的终止第43页/共156页第44页/共156页第45页/共156页DNA聚合酶III第46页/共156页细菌DNA的形复制10～100

mm

复制叉复制叉复制原点真核生物DNA的多点复制第47页/共156页二、微生物遗传信息的表达（一）DNA的复制（二）基因的转录（三）多肽链的翻译第48页/共156页（二）基因的转录参与转录（transcription）的物质：原料NTP、模板DNA、RNA聚合酶、其他蛋白质因子转录的不对称性：指导mRNA合成的DNA链称为模板链，DNA仅有一条链可作为转录的模板启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列转录的三个阶段：转录起始、RNA链延伸、转录终止，方向为5’→3’转录后加工：内含子的切除、外显子的连接第49页/共156页第50页/共156页RNA聚合酶第51页/共156页编码链AACTGTATATTA模板链TTGACATATAAT3’5’转录起始点Probnow盒子启动子3510+1转录区第52页/共156页第53页/共156页第54页/共156页二、微生物遗传信息的表达（一）DNA的复制（二）基因的转录（三）多肽链的翻译第55页/共156页（三）多肽链的翻译参与翻译（translation）的物质：氨酰tRNA、成熟mRNA、核糖体（A位点、P位点）、其他蛋白质因子翻译的三个阶段：翻译起始、肽链延长和翻译终止，方向为5’→3’起始密码子：AUG终止密码子：UAA、UAG和UGA翻译后加工：形成的肽链在蛋白伴侣（chaperone）的作用下形成大分子蛋白第56页/共156页第57页/共156页第58页/共156页三、微生物基因表达的调控（一）转录水平调控（二）翻译水平调控第59页/共156页（一）转录水平调控转录水平调控（transcriptionallevel）：控制从DNA模板上转录特异的RNA的速度这是一种最经济的办法，可以免去浪费从mRNA合成蛋白质的各种元件和材料大多数基因表达都属于这种调控第60页/共156页1、负调控负调控（negativeregulation）：调节蛋白与DNA的特定位点相作用，关闭或降低操纵子转录活性的调控方式例子：大肠杆菌乳糖操纵子的负调控第61页/共156页第62页/共156页2、正调控正调控（positiveregulation）：调节蛋白与DNA的特定位点相结合，启动或增强操纵子转录活性的调控方式大肠杆菌乳糖操纵子的正调控第63页/共156页第64页/共156页3、弱化作用弱化作用：是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控，通过操纵子的前导区内类似于终止子结构的一段DNA序列而实现，它并不使正在转录中的mRNA全部都中途终止，而是仅有部分中途停止转录例子：色氨酸操纵子的弱化作用第65页/共156页第66页/共156页三、微生物基因表达的调控（一）转录水平调控（二）翻译水平调控第67页/共156页（二）翻译水平调控翻译水平调控（translationallevel）：又称为转录后调控；在mRNA合成后，通过调节与核糖体的结合速度等控制从mRNA翻译成多肽链的速度这种调控比较少见第68页/共156页1、SD序列与翻译效率SD序列（shinedalgarnosequence)：在mRNA上起始密码子上游有一段富含嘌呤的与16SrRNA区段完全互补的小序列SD序列与16SrRNA的互补程度以及从起始密码子AUG到SD序列的距离都强烈影响翻译起始的效率第69页/共156页2、重叠基因对翻译的影响前一基因终止密码子和后一基因起始密码子有一个核苷酸重叠：使已完成迁移基因翻译的核糖体立即开始另一基因的翻译，保证同一核糖体对两个连续基因进行翻译，从而使两个基因产物在数量上相等终止子和起始密码子之间相隔3个核苷酸：虽两个基因之间没有直接重叠，但基因的SD序列却位于前一个基因终止密码子之前，这也能保证两个基因的等量翻译，也是一种偶联翻译第70页/共156页3、反义RNA的调控作用反义RNA（antisenseRNA）：是具有能与另一“靶”RNA互补结合的碱基序列反义RNA可与mRNA相结合，使核糖体不能翻译或提前终止；或形成RNA-RNA二聚，增加了核酸内切酶的作用特异性从而使mRNA变得不稳定第71页/共156页第72页/共156页第六章微生物的遗传和变异（6学时）第一节微生物的遗传第二节微生物的变异第三节微生物的育种第73页/共156页第二节微生物的变异一、微生物的基因突变二、微生物的基因重组第74页/共156页一、微生物的基因突变（一）基因突变的概念（二）基因突变的类型（三）基因的诱发突变（四）DNA的损伤修复第75页/共156页（一）基因突变的概念基因突变（mutation）：遗传物质核酸中的核苷酸顺序突然发生了可遗传的变化点突变：由于DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变而引起染色体畸变：DNA的大段变化现象，表现为插入、缺失、重复、易位、倒位第76页/共156页突变的特性非对应性：突变的发生与环境因子无对应性稀有性：自发突变率很低，一般在10-6~10-9规律性：特定性状的突变具有一定的规律性独立性：引起各种性状改变的突变彼此是独立的遗传性：突变是可以稳定遗传的回复性：有时突变可以回复可诱变性：通过理化因子等诱变剂的诱变可提高突变率，但不改变突变的本质第77页/共156页一、微生物的基因突变（一）基因突变的概念（二）基因突变的类型（三）基因的诱发突变（四）DNA的损伤修复第78页/共156页（二）基因突变的类型1、根据结构改变2、根据表型改变第79页/共156页1、根据结构改变同义突变：是指某个碱基的变化没有改变产物氨基酸序列（简并密码子）的变化错义突变：是指某个碱基的变化引起了产物氨基酸的改变；有时影响到蛋白质活性甚至使之失活无义突变：是指某个碱基的改变，使蛋白质合成提前终止(UAA，UAG，UGA)，产生截短的蛋白质移码突变：由于DNA序列中发生1-2个核苷酸的缺失或插入，使翻译的阅读框发生改变，从而导致之后氨基酸序列的完全变化第80页/共156页第81页/共156页2、根据表型改变形态突变型：是指造成形态改变的突变型，包括细胞形态和菌落形态以及噬菌斑形态等生化突变型：是指造成代谢途径变异的突变型，如营养缺陷型、抗性突变型等致死突变型：是指导致个体死亡的突变型条件致死突变型：是指在某一条件下具有致死效应的突变型，如温度敏感突变型第82页/共156页一、微生物的基因突变（一）基因突变的概念（二）基因突变的类型（三）基因的诱发突变（四）DNA的损伤修复第83页/共156页（三）基因的诱发突变诱发突变：并非是用诱变剂产生新的突变，而是通过不同的方式提高突变率；自发突变的频率是很低的，一般为10-6-10-10诱变剂(mutagen)：是指能够提高基因突变率到自发突变水平以上的物理、化学或生物因子诱变剂的主要包括碱基类似物、插入染料、强氧化剂、辐射、噬菌体等第84页/共156页1、碱基类似物碱基类似物：在DNA复制过程中能够整合进DNA分子，但由于它们比正常碱基产生异构体的频率高，因此出现碱基错配的机率也高，从而提高突变频率例如：5-溴尿嘧啶(胸腺嘧啶结构类似物)和2-氨基嘌呤(腺嘌呤结构类似物)第85页/共156页第86页/共156页2、插入染料插入染料：是一类扁平的具有三个苯环结构的化合物，在分子形态上类似于碱基对的扁平分子，它们通过插入DNA分子的碱基对之间使其分开，从而导致DNA在复制过程中的滑动，这种滑动增加了一小段DNA插入和缺失的机率，导致突变率的增加，常引起移码突变例如：溴化乙锭和吖啶橙第87页/共156页第88页/共156页3、强氧化剂亚硝酸：能引起含NH2基的碱基(A.G.C)产生氧化脱氨反应，使氨基变为酮基，从而改变配对性质造成碱基置换突变羟胺：只和胞嘧啶发生反应，因此只引起GC→AT的转换烷化剂：如甲磺酸乙酯(EMS)和亚硝基胍(NTG)，烷基化位点主要在鸟嘌呤的N-7位和腺嘌呤N-3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误第89页/共156页第90页/共156页4、辐射和热紫外线(UV)：由UV引起的主要损伤是相邻碱基形成二聚体，阻碍碱基的正常配对而导致碱基置换突变电离辐射：x-射线、r-射线，快中子等，作用机理尚不十分清楚短时间的热处理：使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶，从而导致GC→AT的转换第91页/共156页第92页/共156页5、生物诱变因子转座因子：也是实验室中常用的一种诱变因子，它们在基因组的任何部位插入，一旦插入某基因的编码序列，就引起该基因的失活而导致中断突变，而且由于转座因子Tn、Mu带有可选择标记(抗生素抗性等)，因此可容易地分离到所需的突变基因第93页/共156页一、微生物的基因突变（一）基因突变的概念（二）基因突变的类型（三）基因的诱发突变（四）DNA的损伤修复第94页/共156页（四）DNA的损伤修复DNA损伤的修复和基因突变有密切的关系，突变往往是DNA损伤与损伤修复这两个过程共同作用的结果根据修复途径和参加修复的酶类差异，大致可将DNA的损伤修复分为光修复、切除修复、重组修复和SOS修复第95页/共156页1、光修复光修复：也叫做光复活作用，一种高度专一的修复方式，只作用于由紫外线引起的DNA嘧啶二聚体的修复光复活酶在光照的情况下吸收光能而被激活从而切断二聚体之间的连接而恢复原状第96页/共156页第97页/共156页2、切除修复切除修复：在暗环境下，特异性酶识别DNA链中的损伤部位，将其分别切离，在DNA聚合酶Ｉ和连接酶的作用下完成修复切除修复包括核苷酸切除修复和碱基切除修复两大类第98页/共156页第99页/共156页3、重组修复重组修复：必须在DNA进行复制的情况下进行，故又称复制后修复RceA蛋白结合在有缺口的单链DNA上，并与完整双链的同源区配对形成三链区，由完整双链中的母链与带缺口的子链发生重组子链中的缺口由母链添边，而母链中失去的部分则由DNA聚合酶和连接酶进行修复第100页/共156页4、SOS修复SOS修复：SOS是一组修复基因，包括recA、lexA、uvrA等，它们为DNA的损伤所诱导SOS修复是DNA受到重大损伤时的一种应急反应第101页/共156页二、微生物的基因重组（一）原核微生物的基因重组（二）真核微生物的基因重组第102页/共156页基因重组基因重组（generecombination）：是指两个不同来源的遗传物质进行交换，经过基因的重新组合，形成新基因型的过程自然发生：原核微生物主要包括转化、转导、接合等方式；真核微生物主要包括有性杂交、准性杂交等人工操作：主要包括诱变育种、原生质体融合、基因工程等手段第103页/共156页（一）原核微生物的基因重组1、转化2、转导3、接合第104页/共156页1、转化转化(transformation)：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段，并组合到其基因组中，从而获得供体菌部分遗传性状的现象可分为自然转化和人工转化第105页/共156页第106页/共156页2、转导转导(transduction)：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象可分为普遍性转导和局限性转导第107页/共156页第108页/共156页比较项目普遍性转导局限性转导转导的发生自发人工诱导噬菌体形成错误的装配前噬菌体的反常切除形成机制包裹选择模型杂种形成模型内含DNA只含宿主染色体DNA含噬菌体和宿主DNA转导性状供体的任何性状前噬菌体邻近两端的DNA片断转导过程通过双交换使转导DNA替换了受体DNA同源区转导噬菌体插入，使受体菌为部分二倍体转导子不能使受体菌溶源化，转导特性稳定为缺陷溶源菌，转导特性不稳定第109页/共156页3、接合接合(conjugation)：通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程，也称杂交接合菌株包括F+菌株、F-菌株、Hfr菌株和F′菌株等第110页/共156页第111页/共156页二、微生物的基因重组（一）原核微生物的基因重组（二）真核微生物的基因重组第112页/共156页（二）真核微生物的基因重组1、有性杂交2、准性生殖第113页/共156页1、有性杂交有性杂交：是指微生物性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传后代的一种育种技术凡能产生有性孢子的酵母菌和霉菌都可采用此法第114页/共156页2、准性生殖准性生殖（parasexuality）：类似于有性生殖；是指同种微生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不经过减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子的一种原始生殖方式常见于某些丝状真菌第115页/共156页第116页/共156页第117页/共156页第六章微生物的遗传和变异（6学时）第一节微生物的遗传第二节微生物的变异第三节微生物的育种第118页/共156页第三节微生物的育种一、诱变育种二、基因工程育种第119页/共156页微生物育种的手段杂交育种：供体菌和受体菌通过有性杂交等，从杂交子代中筛选出优良性状的菌株诱变育种：用诱变剂处理受体菌，使DNA发生改变，使遗传性状发生变异，筛选出所需菌株基因工程育种：提取供体菌的DNA，在体外进行切割后与载体连接，导入受体菌内复制或表达，筛选出所需菌株第120页/共156页一、诱变育种（一）挑选优良的出发菌株（二）制备菌悬液（三）诱变处理（四）突变菌株的筛选第121页/共156页第122页/共156页（一）挑选优良的出发菌株以单倍体纯种为出发菌株，可排除异核体和异质体的影响采用具有优良性状的菌株，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株选择对诱变剂敏感的菌株第123页/共156页一、诱变育种（一）挑选优良的出发菌株（二）制备菌悬液（三）诱变处理（四）突变菌株的筛选第124页/共156页2、制备菌悬液在诱变育种中，所处理的细胞必须是均匀状态的单细胞悬液；分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，又可避免长出不纯菌落在实际工作中，要得到均匀分散的细胞悬液，通常可用无菌的玻璃珠来打散成团的细胞，然后再用脱脂棉过滤诱变霉菌或放线菌时，应处理它们的孢子；对芽孢杆菌则应处理它们的芽孢第125页/共156页一、诱变育种（一）挑选优良的出发菌株（二）制备菌悬液（三）诱变处理（四）突变菌株的筛选第126页/共156页（三）诱变处理选择简便有效、最适剂量的诱变剂：紫外线、硫酸二乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)和亚硝基甲基脲(NMU)等利用复合处理的协同效应：一类是两种或多种诱变剂的先后使用；第二类是同一种诱变剂的重复使用；第三类是两种或多种诱变剂的同时使用第127页/共156页菌种单独处理复合处理诱变剂突变率(%)诱变剂突变率(%)土曲霉紫外线X射线21.319.7X射线+紫外线42.8土曲霉氮芥(0.1%)紫外线不明显4.7氮芥+紫外线11.0链霉菌紫外线γ射线31.035.0紫外线+γ射线43.6金色链霉菌二乙烯三胺硫酸二乙酯紫外线6.061.7812.5二乙稀三胺+紫外线硫酸二乙酯+紫外线26.635.86第128页/共156页1、紫外线的使用在诱变处理前，先开紫外灯预热20分钟，使光波稳定将3～5ml细胞悬浮液置6cm培养皿中，置于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射3～5分钟进行表面杀菌打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌处理一定时间后，在红光灯下，吸取一定量菌液经稀释后，取0.2ml涂平板，或经暗培养一段时间后再涂平板第129页/共156页2、5-溴尿嘧啶的使用称取5-BU，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml将细胞培养至对数期并重悬浮于缓冲液或生理盐水中过夜，使其尽量消耗自身营养物质将5-BU加入培养基内，使其终浓度一般为10～20μg/ml，混匀后倒平板，涂布菌液，使其在生长过程中诱变，然后挑单菌落进行测定处理孢子悬浮液时，可采用较高浓度的5BU(100～1000μg/ml)与孢子悬浮液混合后振荡培养，经一定时间后适当稀涂平板第130页/共156页一、诱变育种（一）挑选优良的出发菌株（二）制备菌悬液（三）诱变处理（四）突变菌株的筛选第131页/共156页（四）突变菌株的筛选营养缺陷型突变株：通过外加限量的所要求的营养物，克服生长的障碍，而又使最终产物不致于积累到引起反馈调节的浓度，从而有利于中间产物或某种最终产物的积累抗阻遏和抗反馈突变型：都是由于代谢失调所造成的，它们都有共同的表型，即在细胞中已经有大量最终代谢产物时仍然继续不断地合成这一产物抗性突变株：筛选各种抗性突变型是生产上常用来提高某些代谢产物的重要途径第132页/共156页二、微生物的基因工程（一）目的基因的克隆（二）克隆载体的选择（三）目的基因与载体的体外重组（四）重组载体引入受体细胞（五）转化子的筛选和重组子的鉴定第133页/共156页基因工程的概念基因工程：是用人工方法将所需要的某一供体生物的DNA提取出来，在体外进行切割后，将其载体DNA分子连接起来，然后导入受体细胞中使之复制、表达，从而获得新的性状基因工程的基本操作如下图所示：第134页/共156页第135页/共156页（一）目的基因的克隆提取总DNA，设计引物，PCR扩增通过反转录酶的作用由mRNA合成cDNA(互补DNA)，RT-PCR扩增根据蛋白质肽链中氨基酸序列来设计特定的DNA序列，PCR扩增用化学方法合成特定功能的基因第136页/共156页第137页/共156页三、微生物的基因工程（一）目的基因的克隆（二）克隆载体的选择（三）目的基因与载体的体外重组（四）重组载体引入受体细胞（五）转化子的筛选和重组子的鉴定第138页/共156页（二）克隆载体的选择载体是一个有自我复制能力的复制子载体能在受体细胞内大量增殖，有较高的复制率载体最好只有一个限制性内切酶的切口，使目的基因能固定地整合到载体DNA的一定位置上载体上必须有一种选择性遗传标记，如具有四环素、氨苄青霉素等的抗性基因第139页/共156页载体的种类原核受体细胞的载体：主要有细菌质粒(松弛型)和λ噬菌体两类真核细胞的载体：主要有SV4病毒和酵母YAC第140页/共156页第141页/共156页三、微生物的基因工程（一）目的基因的克隆（二）克隆载体的选择（三）目的基因与载体的体外重组

（四）重组载体引入受体细胞（五）转化子的筛选和重组子的鉴定第142页/共156页（三）目的基因与载体的体外重组酶切：对目的基因与载体均采用同一种限制性内切酶处理，从而获得互补粘性末端或人工合成粘性末端连接：然后把两者放在较低的温度(5~6℃)下混合“退火”，粘性末端上碱基互补的片段重新配对，形成双链，在DNA连接酶的作用下，目的基因与载体形成一个完整的有复制能力的环状重组体—嵌合体第143页/共156页1、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶：2