微生物检验与控制

微生物检验与控制第1页/共96页

药品微生物检验与控制

第2页/共96页培训主题：1、新修订的“微生物限度检查法”介绍2、药品微生物实验室质量管理和质量保证3、药品微生物检验操作技术4、洁净环境微生物监测3第3页/共96页4第4页/共96页5第5页/共96页中国药典修订版整体特点：微生物检验方法与国外药典接近符合微生物生长特性（利于微生物的检出、更易生长）标准与国际药典USP/EP/JP相近第6页/共96页无菌控制也适用于非无菌产品（无菌观念：不要人为引入微生物）控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物质量的保证微生物学是开发、生产及成品测试的一部分第7页/共96页非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法第8页/共96页主要特点需氧菌概念？回收率测试方法与合格限度第9页/共96页培养基适用性检查：培养基：胰酪大豆胨琼脂/胰酪大豆胨肉汤？

TSA/TSB

沙氏葡萄糖琼脂/沙氏葡萄糖肉汤

SDA第10页/共96页需氧菌总数计数：培养基：胰酪大豆胨琼脂TSA试验菌株：金黄色普通球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌（？）接种量：不大于100cfu（以前是多少？）培养条件：温度：30-35℃

时间：不超过3天；不超过5天第11页/共96页霉菌和菌总数计数：培养基：沙氏葡萄糖琼脂SDA试验菌株：白色念珠菌、黑曲霉菌接种量：不大于100cfu培养条件：温度：20-25℃（？）

时间：不超过5天第12页/共96页培养基适用性检查：范围：

-成品培养基（新引入概念）（？）

-由脱水培养基制成的培养基

-按处方配制的培养基第13页/共96页培养基适用性检查合格标准：1、回收率比值：0.5-2范围内（以前是多少？）；2、菌落：形态大小与对照培养基一致；（平板上长五花八门的菌落怎么办？）3、液体培养基：被检液体培养基与对照培养基比较，生长良好。第14页/共96页回收率：USP34-61：

Forsolidmedia,growthobtainedmustnotdifferbyafactorgreaterthan2fromthecalculatedvalueforastandardizedinoculum。对于固体培养基，获得的生长结果不得超过由标准接种而来的计算值的两倍范围。

对照组计数——————≤测试组计数≤2X

对照组计数

2第15页/共96页计数方法适用性试验：实质：微生物计数方法验证。几个数字要求：

-接种菌悬液的体积不大于供试液的1%-菌悬液含菌量不大于100cfu

-抗菌或抑菌活性的标准：回收率低于50%（？）（涂布法：涂布时候0.1ml里应含有100cfu菌悬液，所以可用上一级的稀释液）第16页/共96页微生物测试方法平皿法

1、倾注法；2、涂布法（新增）薄膜过滤法MPN法（一般用在食品行业）第17页/共96页涂布法：新引入的方法关键点：涂布供试液不少于0.1mL.第18页/共96页微生物限度标准解释：101可以接受的最大菌数为20；102可以接受的最大菌数为200；103可以接受的最大菌数为2000；第19页/共96页非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法第20页/共96页培养基适用性检查培养基促生长能力检查

分离培养基在规定的最短时间内促生长能力考察。

培养基抑菌能力检查

分离培养基在规定的最长时间内的抑菌能力考察。第21页/共96页检验方法适用性试验：实质：控制菌检验方法验证。

适用性试验：

规定最短时间培养，试验菌检出能力试验。第22页/共96页供试品检查：规定最长时间下的控制菌试验。第23页/共96页微生物控制菌检验结果解释：-阳性。产品报废。-阴性，（1）未检出；

（2）非控制菌。怎么办？第24页/共96页微生物实验室检验技术第25页/共96页作为重要组成的微生物控制：原料和组分的微生物控制（源头）环境的微生物控制（动态时取样点如何确定？）生产过程的微生物控制（比A级区更好的区域是什么？）成品的微生物控制所有微生物控制的整合人员的微生物控制第26页/共96页微生物实验室重要的控制点：-无菌技术（人员是关键）-培养基控制-菌种控制-设备控制-实验室布局和运作-数据文件控制-员工培训第27页/共96页无菌技术：防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法。

-无菌环境

-灭菌

-消毒

-卫生要求

-无菌操作技术第28页/共96页培养基微生物实验室工作质量的核心是培养基，应根据既定的目的选用正确的培养基。生产商应提供相关的COA和说明书:-配制

-储存

-菌种选用水:-纯化水，去离子水，蒸馏水

-记录用量成分的测量:-校准过的天平，天平的量程应准确

-清洁的容器和工具

-记录称量第29页/共96页培养基不要过度加热-加热帮助溶解，通常培养基变深说明过度加热-添加剂加入后需充分混合清洁的玻璃器皿

-防止外来污染和抑菌剂

-玻璃器皿清洁第30页/共96页培养基灭菌条件

-供应商提供参数，或自己验证

-高压蒸汽灭菌，过滤除菌

-验证应考虑无菌和培养基生长能力

-湿热灭菌要考虑装载分布，通常121℃15min（我们应该怎么做？）第31页/共96页培养基灭菌条件

-在无菌和过度加热之间平衡

-消毒锅灭菌结束后，不建议在其中存储培养基

-不正确的加热、灭菌条件会影响培养基的颜色澄清度

pH

凝固能力促生长能力选择性

第32页/共96页制备培养基的储存:-低于0℃，凝胶结构破坏

-避光避热

-琼脂培养基密封融化

-重复融化应被限制（不超过一次），防止过度加热或潜在污染

-融化时，使用水浴或流通蒸汽微波炉，热板要防止过度加热

-融化的培养基储存在40~45℃水浴不应超过8小时浇制平皿前擦干

第33页/共96页培养基应标示:-制备批号

-制备日期，有效期

-培养基名称有效期确定

-根据成分，配方，容器，储存条件等确定

-生长能力试验数据支持第34页/共96页培养基储存:培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下储存培养基储存不得超过有效期重要区域环控用培养基必须

-双层包装

-最终灭菌（？），否则进行全数预培养及用前检查成品TSA平板可直接放常温？第35页/共96页培养基质量控制：所有待用的培养基应检查：-生长能力每批制备的培养基均需进行测试菌种根据药典，供应商说明及环境中分离得到的菌株

生长能力测试不合格

-调查

-不得使用该批号-无菌-pH，±0.2(琼脂有什么好的测试方法？)-容器/平皿的完整性-抑制或指示能力定期稳定性检查以确认储存效期第36页/共96页微生物菌种保藏：？建立标准程序处理、保存菌种。防止污染和特性变化-必须小心地处理-使用前确认菌种的身份，纯度-根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术--70℃以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期-开启后不要重新冷冻菌种-追溯传代次数，不超过五代（？）第37页/共96页实验室设备维护-绝大部分实验室设备需要进行标准的验证（IQ、OQ、PQ）-定期校准、保养-定期进行性能检查-根据设备的特性和使用状况确定频率-定期清洁、消毒第38页/共96页实验室布局和运作：目的：实验室布局应该有利于实验室运作。

-防止交叉污染

-活动分区

-注意安全实验室应通过不同的进入通路和隔断来区分“洁净”区和“阳性”区，包括更衣，清洁，消毒。洁净区的生物安全柜仅用于无菌和洁净的操作。样品发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区第39页/共96页样品处理：-大部分样品，水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感。-减少样品，取样与测试间的间隔时间，并控制储存条件。-远距离的转移需确认转移条件对测试及样品的影响。-可能的话，在无菌条件下，使用无菌技术取样，即使是非无菌样品。-取样记录样品信息、取样日期、送样日期、人员/部门，实验室样品，接受及确认第40页/共96页人员培训：制药企业微生物实验室人员-应该接受过微生物学或相关健康科学的正规学习（在校学习）-相关SOP的培训-被赋予保持其技术和经验的职责程序—SOP应易于理解并作为培训计划的基础—SOP的编号或标题提供了一个便利的将培训文件化方法每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前资质确认第41页/共96页文件：实验室文件至少包括（不仅限于此）：-微生物人员培训和能力确认（上岗资质）-设备验证、校准和维护-测试中的设备性能（如温度记录）-培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性能力-培养基清单与控制-根据程序进行测试的重要参数-数据和计算的确认-经QA人员或相应领导审核过的报告-超标调查结果第42页/共96页实验室结果：记录重要的测试步骤及参数，用以确认结果的完整性，并为能重复测试提供信息至少应包括（不仅限于此）：-日期-测试样品-微生物检验人员名字-程序编号-测试结果-偏差（如有）-测试参数(设备，菌种，培养基)-管理人员审核签名第43页/共96页实验室维护：设备-重要设备记录在测试记录上-校准计划-适用的话，有使用记录-重要的温度记录（水浴，培养箱，灭菌锅）应该具溯源性数据纠错-错误的地方划一横线，签名和日期空白纸应如何划掉？第44页/共96页洁净环境微生物测试与评估第45页/共96页环境监测体系1、清洁和消毒执行清洁和消毒程序是整个工厂管理的重要组成。要用环境监测数据来评价这些程序的有效性影响消毒消毒的因素：消毒剂类型，左右时间，待消毒表面消毒剂效率测试残留去除第46页/共96页环境监测体系2、取样位置的选择：哪些部位的微生物污染最可能对产品质量造成不良影响？在生产过程中，什么地点最容易长菌？取样点的选择需要统计学设计或根据网格法来确定？在常规监测中，有一些点需要周转取样吗？哪些地方是清洁、消毒或灭菌时最难覆盖/接触或最难凑效的部位？什么活动会导致污染的扩散？在某一部位的取样操作，足以导致测试数据的差错或污染产品？取样只应在生产结尾换班时进行吗？第47页/共96页环境监测体系3、取样频率批生产动态监测日常监测轮转监测选择取样频率的关键点是尽可能鉴别出系统潜在的缺陷。第48页/共96页尘埃粒子和微生物非生物粒子数量和活的微生物浓度之间的关系在科学上未达成绝对的一致当操作人员是粒子的来源时，以下的结论是成立的，即洁净室中的粒子越少，空气中微生物存在的可能性就越小。第49页/共96页洁净环境监测-大量的药品除了微生物以外还有粒子限度的要求-部分悬浮粒子与微生物有关-洁净室监测计划包括微生物与粒子数两方面是正常的及恰当的第50页/共96页环境微生物监测方案：1、需氧微生物监测2、霉菌/酵母菌监测通常厌氧菌不必常规检测，但如果无菌环境中发现此类微生物，需增加取样频率。第51页/共96页洁净环境监测主要方面：微生物监测第52页/共96页无菌药品：没有任何活体微生物的药品。（理论定义）符合现行质量标准的药品。

检验项目：无菌检验限度规格：检验结果阴性检验方法：现行药典的检验方法取样方法：现行药典规定的取样方法第53页/共96页

无菌产品Vs

无菌检验合格

整批产品无菌=

无菌检验合格的产品

无菌检验合格的产品≠整批产品无菌第54页/共96页无菌检验的局限性：无菌检验无法对整批产品进行100%检验用于无菌检验的培养基存在局限性无菌检验环境只是一个相对无菌的环境（如果A级长菌了，应该怎么办？）第55页/共96页洁净区微生物监测的动态标准（GMP2010版）洁净度级别浮游菌cfu/m3沉降菌（90mm）cfu/4小时表面微生物接触（55mm）cfu/碟5指手套cfu/手套A级1111B级10555C级1005025－D级20010050－第56页/共96页洁净室微生物监测的三个方面：第一、浮游菌第二、沉降菌第三、表面微生物第57页/共96页环境监测取样点的设置（动态、静态？）应该考虑但不局限于以下因素：该点最易受微生物污染，很有可能对产品质量造成不良影响该点在实际生产中微生物便于微生物繁殖统计学上的要求（不能一个点，太少，要2-3个）该点不易清洁、消毒房间的洁净度级别可能污染产品的采样点第58页/共96页取样频率：单一取样方案不适合于所有环境。选择监测频率的关键是能够确定潜在的系统缺陷。每个点的检验频率可以少于系统或区域的检验频率。在多种情况下，批生产时进行监测可以满足常规区域监测的要求。第59页/共96页采样点示例：系统采样点洁净空气近开放口/灌装头室内空气靠近工作区生产用水使用点表面（设施）地面、门把手、墙面、容器表面表面（设备）灌装线、控制面板、胶塞容器压缩空气距离压缩机最远端无菌试验装置靠近真空源处灌装线操作人手指取样层流空气活动频繁处第60页/共96页MMSCIP灭菌直接包材接触部0.45±20%m/sGrade”A”Grade”B”风险点操作者不能进入Grade”A”区域。关键点第61页/共96页无菌生产区的环境监测：1、考虑以下方面：

-洁净度级别

-空调净化系统验证中获得的结果

-风险评估2、合理确定取样点的位置：

-污染风险分析

-每个位置与工艺的关系

-对人流和物流有良好理解

-强调产品存在风险的区域第62页/共96页沉降菌监测采样点的位置

a)工作区采样点位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）？

b)可在关键设备或关键工作活动范围处增加测点。第63页/共96页沉降菌监测最小培养皿数第64页/共96页沉降菌测试时间沉降平皿的暴露时间少于4小时；如果同一位置使用多个沉降平皿进行监测并累计计数，单个沉降平皿的暴露时间可以少于4小时。第65页/共96页表面微生物取样点设置

取样点

设置原则设备表面是否与产品接触墙面距离地面高度约1.2-1.5m处地面房间中央，人员活动较多处洁净服表面袖口，肘部，胸前等第66页/共96页环境监测培养基的选择……第67页/共96页微生物总数细菌数：在细菌培养基上菌落形成单位的平均数。真菌数：在真菌培养基上菌落形成单位的平均数。微生物总数=细菌数+真菌数第68页/共96页细菌、真菌培养基：中国药典欧洲药典细菌营养琼脂30～35℃3天TSA30～35℃5天霉菌、酵母菌玫瑰红钠琼脂23～28℃5天SDA20～25℃5天酵母菌酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂23～28℃5天/第69页/共96页GB/T16293-2010GB/T16294-2010采用大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）配制的培养皿经采样后，在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于2d；采用沙氏培养基（SDA）配制的培养皿经采样后，在20℃～25℃培养箱中培养，时间不少于5d。第70页/共96页微生物计数的困惑

！细菌培养基上生长的真菌如何计数？真菌培养基上生长的细菌如何计数？第71页/共96页总好氧微生物数（TAMC）：定义：在TSA（大豆酪蛋白琼脂）培养基上生长的包括真菌的菌落形成单位总的数量。培养温度/时间：1、细菌：30～35℃5天。

2、细菌：30～35℃2天；霉菌或酵母菌：20～25℃3天。第72页/共96页酵母菌和霉菌总数（TYMC）：定义：在SDA（沙氏葡萄糖琼脂）培养基上生长的包括细菌的菌落形成单位总的数量。培养温度/时间：20～25℃5天。第73页/共96页计数原则：1、TAMC时，如果真菌被发现生长，应该被作为TAMC计数的一部分。2、TYMC时，如果细菌被发现生长，应该被作为TYMC计数的一部分。3、当TYMC由于细菌的生长而超过了可接受标准，应当使用含有抗生素的SDA培养基。第74页/共96页培养条件：第75页/共96页CHP2010第76页/共96页《中国药典》2010年版二部

附录XIXQ“药品微生物实验室规范指导原则”用于环境监测的培养基须特别防护，最好要双层包装和终端灭菌，如果不能采用终端灭菌的培养基，那么在使用前应进行100%的预培养以防止外来的污染物带到环境中以避免出现假阳性的结果。第77页/共96页<1117>微生物良好实验室规范第78页/共96页USP<1116>MICROBIOLOGICALEVALUATIONOFCLEANROOMSANDOTHERCONTROLLEDENVIRONMENTS洁净室和其他受控环境的微生物学评估

…mediashouldbeexaminedforsterilityandforgrowthpromotionasindicatedunderSterilityTests71

…培养基也应像无菌检测<71>中标示的那做无菌检测和促生长检验。第79页/共96页假阳性（Falsepositive）测试结果实际应该没有微生物生长，但被判为发现生长或阳性。产生原因：

1、非无菌培养基平板引人污染；

2、非无菌操作带来污染。

第80页/共96页假阴性（Falsenegative）测试结果实际应该有微生物生长，但被判为未见生长或阴性。产生原因：

1、培养基选择不正确；

2、培养基促生长试验失败；

3、培养条件不正确。

第81页/共96页GB/T16293-2010/GB/T16293-2010附录B:B.3培养基平皿培养及保存制备好的培养基平皿宜在2～8℃保存，一般以一周为宜或按厂商提供的标准执行。采用适宜的方法在平皿上做好培养基的名称、制备日期剂量的标记。

第82页/共96页环境测试培养基：1、TSA（大豆酪蛋白琼脂）用于细菌取样。

培养温度/时间：30～35℃

不少于2天。2、SDA（大豆酪蛋白琼脂）用于霉菌和酵母菌取样。

培养温度/时间：20～25℃不少于5天。第83页/共96页环境测试培养基：3、用户认可并验证了的培养基。以上摘自：GB/T16293-2010GB/T16294-2010第84页/共96页环境监测中常忽视的两个方面：1、忽视洁净环境中的影响因素2、忽视培养基的选择第85页/共96页

消毒