微生物制药下游技术

微生物制药下游技术第1页/共170页2‹#›微生物制药下游技术3.1引言3.2微生物破壁3.3沉淀法3.4吸附法3.5溶剂萃取3.6两水相萃取法3.7膜分离第2页/共170页3‹#›3.8色谱的基本原理和参数3.9离子交换色谱3.10扩展床吸附分离3.11凝胶色谱3.12亲和色谱3.13疏水作用色谱3.14结晶法微生物制药下游技术第3页/共170页4‹#›3.1.1生物下游技术的特点1、培养物中所含欲提取的生物物质浓度很低，但杂质含量很高；2、欲分离的生物分子通常很不稳定，高热、极端pH、有机溶剂等都会导致失活；3、发酵培养常常是分批发酵，各批次发酵液的组成与性质不尽相同。下游加工过程应遵循的原则：1、时间短；2、温度低；3、pH适当；4、勤清洗消毒。3.1引言第4页/共170页5‹#›3.1.2生物技术的一般流程和单元操作3.1.2.1一般工艺流程下游加工过程一般可以分为4个阶段：1、发酵液的预处理和固液分离；2、初步纯化（提取）；3、高度纯化（精制）；4、成品加工。

一般工艺流程：发酵液预处理细胞分离细胞破碎细胞碎片分离初步纯化高度纯化成品加工第5页/共170页6‹#›第6页/共170页7‹#›3.1.2.2发酵液的预处理和固液分离发酵液预处理的目的在于改变发酵液的性质，以便固液分离。在活性物质稳定的范围内，通过酸化、加热以降低发酵液的黏度，或加入絮凝剂，使细胞或溶剂的大分子聚结成较大的颗粒。实验室常用的固液分离的方法有离心和过滤。工业常用的固液分离方法有：鼓式真空过滤机、离心机、硅藻土过滤机等。第7页/共170页8‹#›3.1.2.3细胞破碎及碎片的分离细胞破碎的方法：机械法(超速、碾磨、搅拌等）；生物法（酶解、自溶）；化学法（有机溶剂等）。实验室常用方法：超声破壁、匀浆机、组织捣碎、酶解（溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶）、冻融等。大规模生产常用高压匀浆器和球磨机等。匀浆器主要是用液相剪切力和与固定表面撞击所产生的应力，球磨机主要依靠碾磨。第8页/共170页9‹#›3.1.2.4初步纯化（重在浓缩，也有纯化）（1）吸附法主要用于抗生素、氨基酸等小分子物质的提取，利用吸附剂与目标产物之间的分子引力而将其吸附在吸附剂上。常用的吸附剂有活性炭、氧化铝和各种离子交换树脂等。活性炭用得最广泛，但有很多缺点：1、吸附性能不稳定；2、选择性不高；3、可逆性差；4、不能连续操作；5、碳粉还会影响环境卫生。第9页/共170页10‹#›（2）沉淀法广泛用于蛋白质的提取中，它主要起浓缩作用，纯化的效果差。有以下5中类型：A、盐析B、加入有机溶剂C、挑pH至等电点D、加入非离子型聚合物E、加入聚电解质第10页/共170页11‹#›（3）溶剂萃取法一般多用于抗生素等小分子生物药物的提取。原理：处于不同化学状态的抗生素，在水及水不互溶的溶剂中有不同的溶解度。（4）双水相萃取法多适合蛋白质的提取。聚合物分子有不相容性，两种聚合物的水溶液可以分为两相。由于蛋白质极性的差异，蛋白质分子可以在两相间进行分配。影响分配系数的因素有：聚合物的种类和浓度、聚合物的分子量、离子的种类、离子强度、pH和温度等。第11页/共170页12‹#›（5）离子交换法主要用于蛋白质、氨基酸及抗生素等两性带电生物分子的提取。离子交换法利用离子交换树脂和生物分子之间的化学亲和力，有选择性地将生物质吸附上去，然后用较少量的洗脱剂将其洗脱下来。（6）超滤法适合于超滤膜分离的物质，分子量在500-1000000Da之间，或分子颗粒大小近似在1-10nm之间。超滤是利用不同截留分子量的超滤膜进行溶质分离或浓缩的技术。第12页/共170页13‹#›3.1.2.5精制通过初步纯化后，体积已大为缩小，但纯度不高，需进一步精制。大分子物质的精制一般用色谱分离，小分子物质的精制一般利用结晶。（1）色谱分离色谱操作多是在柱中进行，有固定相和流动相两部分，根据物质在两相间分配系数不同，在柱中的保留值也不同而获得分离。第13页/共170页14‹#›（2）结晶主要用于低分子量物质的纯化。结晶的前题条件是溶液要达到过饱和。达到过饱和的方法有：A、加入某些物质，改变溶剂平衡点；B、将溶液冷却或将溶剂蒸发；C、正确控制温度、溶剂的加入量和加料速度可以控制晶体的生长。第14页/共170页15‹#›3.1.2.6成品加工（1）浓缩

浓缩可以采用升膜或降膜式的薄膜蒸发，对热敏性物质，可以采用离心薄膜蒸发器，而且可以处理黏度大的物料。优点：能耗低，成本低。（2）无菌过滤和去热原传统去热原方法是蒸馏或石棉板过滤法，另外活性炭吸附、色谱操作、超滤和萃取等都有除菌和去热原的效果。第15页/共170页16‹#›（3）填充剂添加分离浓缩后的样品需添加填充剂或保护剂，以保护产品在进一步干燥和储藏过程中的稳定性。蛋白质药物中常用海藻糖和蔗糖。（4）干燥当终产品为固体时，一般需要干燥，以除去残留的水分或溶剂。常用的干燥方法有真空干燥、红外线干燥、沸腾干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。干燥方法的选择应根据物料的性质和状态而定。第16页/共170页17‹#›3.2微生物破壁

微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，还有许多是存在于细胞内部。对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液。对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。微生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。细胞膜主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。第17页/共170页18‹#›细胞壁的组成和破碎阻力细菌：肽聚糖，多糖，磷壁酸，主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质，主要阻力来自于壁结构交换的紧密程度和厚度。真菌：多糖，蛋白质，脂类，葡聚糖，几丁质，主要阻力来自于壁强度和聚合物网状结构。它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度高。back第18页/共170页19‹#›各种微生物细胞壁的结构与组成

第19页/共170页20‹#›

为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状结构的共价键。各种微生物的细胞壁的结构和组成差异很大，壁结构不仅取决于遗传信息，也取决于生长的环境。在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。第20页/共170页21‹#›细胞破碎主要方法

第21页/共170页22‹#›机械破碎法与非机械法比较

第22页/共170页23‹#›3.2.1机械方法为了粉碎微生物细胞，常常选择机械的方法，因为它们的处理量大，破碎速度较快。采用这些方法，细胞受到由高压产生的高剪切力，但在大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。第23页/共170页24‹#›3.2.1.1珠磨机研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。

Mickle高速组织捣碎机和Braun匀浆器是实验室规模的细胞破碎设备，利用玻璃小珠撞击微生物细胞而达到破碎的目的。另外，较大量的微生物细胞可用胶体磨来处理。这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用干冰来冷却容器可得到部分解决。第24页/共170页25‹#›在工业规模的破碎中，可以采用高速珠磨机。在这种设备中，由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式：

ln［l／（l一R）］＝Kt

其中：K—一级反应速度常数；t—时间；R—破碎率。一级反应速度常数K与许多操作参数有关，第25页/共170页26‹#›例如珠体的直径，进入珠磨机的细胞浓度和负荷，料液的流速，搅拌器的转速和构型，以及温度等。这些参数不仅影响破碎程度，也影响所需能量。珠体的大小应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择，珠体在磨室中的装量影响破碎程度和所需能量，破碎面包酵母菌适宜的珠体装量为80％，珠体量的增加使热扩散性能降低而引起温度升高。

增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，所以搅拌转速应适当。第26页/共170页27‹#›3.2.1.2高压匀浆器

采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法。利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。其破碎属于一级反应速度过程，被破碎的细胞分率符合公式：第27页/共170页28‹#›ln[1／（l－R）]＝KNPα其中：R——破碎率；K——与温度有关的速度常数；P——操作压力；N——悬浮液通过匀浆器阀的次数。α——与微生物种类有关的常数；

破碎酵母菌,α值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。第28页/共170页29‹#›3.2.1.3X－press法一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至－25℃至－30℃形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。此法称为X－press法，主要用于实验室中。该法对冷冰－融解敏感的生化物质不适用。第29页/共170页30‹#›3.2.1.4超声波法超声波破碎也是应用较多的一种破碎方法。通常采用的超声波破碎机在15到25千赫（kHz）的频率下操作，细胞的破碎是由于超声波的空穴作用。这种空穴泡由于又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘附性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。超声波振荡容易引起温度的剧烈上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。第30页/共170页31‹#›3.2.2非机械方法许多种非机械方法都适用于微生物细胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击，冻结和融化、热处理、化学法溶胞等，其中某些方法的应用是有限制的。3.2.2.1酶解法酶解法是利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁目的。应用酶解需要选择适宜的酶和酶系统，并要决定特定的反应条件，还常附加其它的处理，如辐照、加高浓度盐及EDTA，或者利用生物因素等促使微生物对酶解作用敏感，以获得一定的效果。第31页/共170页32‹#›酶解的优点是专一性强，发生酶解的条件温和。溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的β一l，4糖苷键，使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。自溶作用是酶解的另一种方法，微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合结构的酶，以便使生长过程进行下去。改变微生物的环境，可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。

第32页/共170页33‹#›影响自溶过程的因素有温度、时间、pH缓冲液浓度、细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶常采用加热法或干燥法。但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会降低。采用抑制细胞壁合成的方法能导致类似于酶解的结果。某些抗生素如青霉素或环丝氨酸，能阻止新细胞壁物质的合成。抑制剂应在发酵过程细胞生长期的后期加入。只有当抑制剂加入后，生物合成和再生还在继续进行，溶胞的条件才是有利的。第33页/共170页34‹#›

3.2.2.2渗透休克法

渗透压冲击是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成受抑制而强度减弱时才是合适的。第34页/共170页35‹#›3.2.2.3冻融法反复冻结—融化，可用于某些细胞的破碎，或释放某些细胞组分。冻结—融化法系将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低，即使反复循环多次也不能提高收率。另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。第35页/共170页36‹#›3.2.2.4干燥法可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。它使细胞膜渗透性改变，当用丙酮、丁醇或缓冲液等溶剂处理时，胞内物质就容易被抽提出来。

空气干燥主要适用于酵母菌，一般在25－30℃的气流中吹干，然后用水、缓冲液或其它溶剂抽提。空气干燥时，部分酵母可能产生自溶。

真空干燥适用于细菌的干燥。

冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质，将冷冻干燥后的菌体在冷冰条件下磨成粉，然后用缓冲液抽提。第36页/共170页37‹#›此外，还能用有机溶剂，例如丙酮、二氧六圜等使细胞脱水，即可将菌体悬浮液慢慢倒入10倍体积预冷至－20℃的丙酮中搅拌，使之脱水，丙酮除能脱水外，还能溶解除去膜上部分脂肪，所以更容易抽提。干燥法条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。此外还可以采用化学法处理来溶解细胞或提取细胞组分。例如酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞内渗漏出来。第37页/共170页38‹#›除上述方法外，某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问题。选择合适的破碎方法需要考虑下列因素：细胞的数量，所需要的产物对破碎条件（温度、化学试剂、酶等）的敏感性；要达到的破碎程度及破碎所必要的速度等，希望尽可能采用最温和的方法。具有大规模应用潜力的生化产品还应选择适合于放大的破碎技术。第38页/共170页39‹#›2008-4-223.3沉淀法沉淀法概述（浓缩作用大于纯化作用）沉淀法的原理：利用物质能和某些酸、碱或盐形成不溶性或复合物沉淀或结晶。加酸、碱、盐、有机溶剂、其它物质。沉淀法的优点：成本低、收率高、适当条件下不会使蛋白质等大分子变性，浓缩倍数高和操作简单等。第39页/共170页40‹#›2008-4-22根据所加入沉淀剂的不同，沉淀法可分为：盐析等电点有机溶剂非离子型聚合物聚电解质高价金属离子第40页/共170页41‹#›

①盐析法；多用于分离纯化各种蛋白质和酶。

②有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸等产品的分离纯化，也有用于蛋白质的沉淀。

③等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀。④生成盐复合物沉淀法：用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。第41页/共170页42‹#›3.3.1盐析法(1)盐溶：[盐]低时，蛋白质S随[盐]增加而增加；第42页/共170页43‹#›(2)盐析：[盐]高时，蛋白质S随[盐]增加而降低；第43页/共170页44‹#›盐析机理示意图

第44页/共170页45‹#›2008-4-22盐析的机理蛋白胶体稳定的原因是蛋白质颗粒周围水化膜和电荷的存在。加入盐，中和表面电荷、破坏水化膜。①盐离子与蛋白质分子争夺水分子，降低了用于溶解蛋白质的有效水量，减弱了蛋白质的水合程度，破坏了蛋白表面的水化膜，导致蛋白质溶解度下降；②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水分子的极化，使水活度降低。第45页/共170页46‹#›2008-4-22蛋白质的溶解度与盐浓度的关系可用下式表示：

logS=β－KS·IS：蛋白质的溶解度；

I：离子强度；

β：常数，与蛋白质种类有关，与盐的种类无关；

KS：盐析常数，与盐种类有关，与温度和pH无关;第46页/共170页47‹#›影响盐析的主要因素1）蛋白质浓度与盐析的关系：高浓度蛋白质溶液可以减少盐的用量，但蛋白质浓度太高，会发生严重的共沉作用；用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻。2）离子强度和种类的影响：盐溶：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对Ks值的影响，Ks值越大，该盐的盐析效果越好。第47页/共170页48‹#›3）温度对盐析的影响：温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小，这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。4）PH对盐析的影响：值除与蛋白质和温度有关外，还与pH有关；盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pH。第48页/共170页49‹#›影响盐析的主要因素盐溶：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对Ks值的影响，，Ks值越大，该盐的盐析效果越好。1）蛋白质浓度

高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻。2）离子强度和种类3）温度温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。4）pH值除与蛋白质和温度有关外，还与pH有关；盐析pH的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pH作为盐析pH第49页/共170页50‹#›无机盐种类的影响不同盐溶液中碳氧血红蛋白的溶解度与离子强度的关系（25℃）

(○)NaCl;(▼)KCl;(◘)MgSO4;(▲)NH4)SO4;(●)Na2SO4;(□)K2SO4;(■)柠檬酸三钠第50页/共170页51‹#›2008-4-223.3.2、等电点沉淀法原理：利用两性电解质在等电点的溶解度最低和不同电解质有不同等电点的特性，将两性电解质分离的方法。通过加酸或碱调pH＝pI，蛋白质分子的净电荷为零，分子聚集在一起。中性盐的浓度增加时，相应于最低溶解度的pH值向偏酸方向移动；同时最低溶解度会有所增大。第51页/共170页52‹#›优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许；缺点：酸化时易引起蛋白失活，因为蛋白质对低PH比较敏感。许多蛋白质的等电点比较接近，故选择性不高。

不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛素的等电点为5.3，在与Zn2+结合形成胰岛素锌盐，其等电点升为6.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要注意调整pH。第52页/共170页53‹#›等电点沉淀实例

从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI＝8.9，可先于pH3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3.0)。工业生产胰岛素(pI＝5.3)时，先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。第53页/共170页54‹#›2008-4-223.3.3有机溶剂沉淀法利用某些物质在有机溶剂中的溶解度不同而使其分离的方法。1.原理：许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用，这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降低水溶液的介电常数，使溶质分子间因引力而凝集。或破坏水膜(降低水活度)而溶解度降低；或破坏蛋白质的肽键，改变其空间结构而使疏水基团暴露而析出。第54页/共170页55‹#›

当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸引力增大，带电溶质互相吸引而聚集。

对于具有表面水层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而相互聚集析出。

不同浓度的有机溶剂可使不同的溶质沉淀，即分步沉淀法，达到分离纯化的目的。第55页/共170页56‹#›2、优缺点优点：分辨能力比盐析法高；一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀不需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，容易进行固液分离；有机溶剂容易蒸发，不会在成品中残留，因此适用于食品、药品的制备。缺点：容易引起蛋白质变性失活，有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。需冷却、降温、低温操作。对同一种溶剂，蛋白质的分子质量越大，沉淀所需有机溶剂的量越少。第56页/共170页57‹#›3.影响有机溶剂沉淀的因素1、有机溶剂的种类：选择的溶剂必须能与水互溶，但与产物如蛋白质等不发生反应。例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖类、氨基酸和核苷酸等物质最常用的沉淀剂；在沉淀过程中，乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，这对热稳定性较差的产物影响较大（少量多次、搅拌）2、温度：多数生物物质在有机溶剂与水的混合液中的溶解度是随温度的降低而降低的，降低温度可以增加收率。同时许多生物分子如蛋白质、核酸等对温度特别敏感，温度稍有升高，便发生变性；低温沉淀还能更好地保护生物物质的活性。第57页/共170页58‹#›3、pH：在结构稳定范围内，选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果。因此在接近等电点处，以引起沉淀所需有机溶剂的量较少。合适的PH也可大大提高分离的分辨能力。4、样品浓度和分子质量：低浓度样品需用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低，具有生理活性的样品容易产生稀释变性。高浓度样品使用有机溶剂的量较小，减少了变性的危险；但共沉作用大，分离效果较差。蛋白质分子质量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。5、金属离子和离子强度：Mn2+、Fe2+、Co2+、Zn2+等阳离子能与蛋白质中的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合，形成难溶复合物，有利于沉淀。但离子强度过大，不利分离。Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能与羧基结合；Ag+、Hg2+能与巯基结合形成复合物；这类复合物在水或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的生物活性，同时还能降低有机溶剂的用量。第58页/共170页59‹#›用于生物物质沉淀的有机溶剂须能与水互溶，但对蛋白无作用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖类、氨基酸和核苷酸等物质最常用的沉淀剂；在沉淀过程中，乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，这对热稳定性较差的产物影响较大（少量多次、搅拌）3、影响有机溶剂沉淀的因素1）有机溶剂的种类2）温度多数生物物质在有机溶剂与水的混合液中的溶解度是随温度的降低而降低的，因此降低温度可增加收率；低温沉淀还能更好地保护生物物质的活性。3）pH在结构稳定范围内，选择溶解度最低时的pH，有助于提高沉淀效果；在接近等电点处，引起沉淀所需有机溶剂的量最小；合适的pH还可大大提高分离的分辨能力4）样品浓度和分子质量低浓度样品需要使用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率低；高浓度样品使用有机溶剂的量较小，减少了变性的危险；但共沉作用大，分离效果较差。蛋白质分子质量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。5）金属离子和离子强度

Mn2+、Fe2+、Co2+、Cu2+、Zn2+

等离子能与蛋白质的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合；

Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+能与羧基结合；

Ag+、Hg2+、Pb2+

能与巯基结合形成复合物；某些有机化合物能与生物大分子形成难容的复合物.这类复合物在水或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的生物活性，同时还能降低有机溶剂的用量。第59页/共170页60‹#›有机溶剂沉淀实例第60页/共170页61‹#›2008-4-22其他方法：非离子型聚合物沉淀法：与有机溶剂相似，能降低水化度。聚电解质：作用机制复杂，有絮凝作用，也有盐析作用，还有降低水化等作用。金属离子：可沉淀低浓度蛋白质第61页/共170页62‹#›3.4吸附法吸附:指物质从流动相浓缩到固体表面从而达到分离的过程称为吸附作用。(该过程包括两相:液相(气相)→固相)

表面能发生吸附作用的固体称为吸附剂(吸附介质),一般为多孔微粒或多孔膜。被吸附的溶质称为吸附物。第62页/共170页63‹#›吸附法的特点：常用于从稀溶液中将溶质分离出来，由于受固体吸附剂的限制，处理能力较小；对溶质的作用较小，这一点在蛋白质分离中特别重要；可直接从发酵液中分离所需的产物，成为发酵与分离的耦合过程，从而可消除某些产物对微生物的抑制作用；溶质和吸附剂之间的相互作用及吸附平衡关系通常是非线性关系，故设计比较复杂，实验的工作量较大。第63页/共170页64‹#›优点：有机溶剂掺入少；操作简便，安全，设备简单；

pH变化小，适于稳定性差的物质。缺点：选择性差；收率低；无机吸附剂性能不稳定；不能连续操作，劳动强度大；碳粉等吸附剂有粉尘污染。第64页/共170页65‹#›1、吸附机制：固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。第65页/共170页66‹#›2、吸附的类型

物理吸附:

吸附剂和吸附物通过分子力产生的吸附。

特点：是放热过程；吸附物分子状态变化不大，需要的活化能很小，多数在较低温下进行；达吸附平衡时间非常短；吸附过程可逆。第66页/共170页67‹#›化学吸附：化学吸附是由于吸附剂和吸附物之间的电子转移，发生化学反应而产生。

特点：释放大量的热；选择性较强；单分子层吸附，稳定，不易解吸。第67页/共170页68‹#›物理吸附和化学吸附的比较

物理吸附化学吸附吸附力范德华力化学键力吸附热较小(～液化热)较大选择性无选择性有选择性稳定性不稳定,易解吸稳定分子层单分子层或多分子层单分子层吸附速率较快,较慢.

受温度影响小受温度影响大物理吸附仅仅是一种物理作用，没有电子转移，没有化学键的生成与破坏，也没有原子重排等。化学吸附相当与吸附剂表面分子与吸附质分子发生了化学反应。第68页/共170页69‹#›

交换吸附：

1、极性吸附:

吸附剂表面如为极性分子所组成，则会吸引溶液中呈相反极性的物质或离子而形成双电层，这种吸附称为极性吸附。

2、离子交换:

在吸附剂与溶液间发生离子交换，即吸附剂吸附离子后，它同时要放出等量的离子于溶液中。离子所带电荷越多，它在吸附剂表面的相反电荷点上的吸附力就越大；电荷相同的离子，其水化半径越小，越容易被吸附。第69页/共170页70‹#›3、吸附力的本质吸附作用最根本因素是吸附质和吸附剂之间的作用力：范德华力：

定向力:极性分子之间产生的作用力，由极性分子的永久偶极距产生的分子间的静电力。

诱导力：极性与非极性分子之间引力，极性分子产生的电场作用会诱导非极性分子极化,产生诱导偶极距，因此两者之间相互吸引。

色散力：非极性分子之间引力，瞬时偶极距。第70页/共170页71‹#›吸附剂的类型多孔型：生物产物的脱色，除臭；活性炭，硅胶、硅藻土。大网格吸附剂：有机高分子材料，如聚苯乙烯，聚酯。凝胶型：纤维素凝胶，琼脂糖凝胶，匍聚糖凝胶。吸附剂的要求：① 自身不溶解，也不破坏或分解被分离物。② 表面积大。③ 大小均匀。第71页/共170页72‹#›吸附剂的性能表征比表面积：单位质量物体所具有的表面积(m2/g)

测量方法：BET法

一般采用B.E.T(Brunueer-Emmett-Teller)法：在液氮温度下(-196°C)，用吸附剂吸附氮气，在吸附剂表面形成单分子吸附层，测定氮气的吸附体积vm(cm3/g)，计算比表面积a(cm2/g): N-阿弗加德罗常数，s-被吸附分子的横截面积，在-196°C氮气分子的s=1.6210-15cm2。第72页/共170页73‹#›第73页/共170页74‹#›4、吸附平衡理论吸附是一种平衡分离方法，根据不同溶质在液固两相间分配平衡的差别实现分离。当溶质在液固两相间达到吸附平衡时，吸附剂上的平衡吸附质浓度q是液相游离溶质浓度c和温度T的函数。吸附等温线当温度一定时，平衡吸附量q与液相游离溶质浓度c之间的函数关系称为吸附等温线。第74页/共170页75‹#›常见吸附平衡等温线1、指数型吸附等温线（线性）：2、多分子型吸附等温线（非线性）3、单分子型吸附等温线（非线性）qm：饱和吸附量；Kd：吸附平衡的解离常数第75页/共170页76‹#›朗格谬尔吸附平衡（单分子层吸附）

理论基础：吸附剂上存在许多活性位点，每个活性位点具有相同的能量，只能吸附一个分子，并且被吸附的分子间无相互作用，从而形成单分子吸附层。第76页/共170页77‹#›2008-4-22

5、影响吸附的因素

1.吸附剂的性质

2.吸附物的性质

3.溶液的pH4.温度

5.其它组分第77页/共170页78‹#›3.5溶剂萃取当含有生化物质的溶液与互不相溶的第二相接触时，生化物质倾向于在两相之间进行分配，当条件选择得恰当时，所需提取的生化物质就会有选择性地发生转移，集中到一相中，而原来溶液中所混有的其它杂质（如中间代谢产物、杂蛋白等）分配在另一相中，这样就能达到某种程度的提纯和浓缩。萃取在化工上是分离液体混合物常用的单元操作，在发酵和其它生物工程生产上的应用也相当广泛，萃取操作不仅可以提取和增浓产物，使产物获得初步的纯化，所以广泛应用在抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物的提取上。第78页/共170页79‹#›

溶剂萃取法是利用一种溶质组分(如产物)在两个互不相溶的液相(如水相和有机溶剂相)中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离的操作。优点：比化学沉淀法分离程度高；比离子交换法选择性好、传质快；比蒸馏法能耗低。还有生产能力大、周期短、便于连续操作、容易实现自动化控制等优点。第79页/共170页80‹#›萃取法是利用液体混合物各组分在某有机溶剂中的溶解度的差异而实现分离的。料液：在溶剂萃取中，被提取的溶液;溶质：其中欲提取的物质;萃取剂：用以进行萃取的溶剂;萃取液：经接触分离后，大部分溶质转移到萃取剂中，得到的溶液;余液：被萃取出溶质的料液称为。第80页/共170页81‹#›萃取过程第81页/共170页82‹#›

萃取过程有选择性能与其它步聚相配合通过相转移减少产品水解适用于不同规模传质快周期短，便于连续操作毒性与安全环境问题溶剂萃取法的特点第82页/共170页83‹#›1、萃取过程的理论基础液液萃取是以分配定律为基础分配定律：一定T、P下，溶质在两个互不相溶的溶剂中分配，平衡时溶质在两相中浓度之比为常数。K-分配系数在常温常压下Ｋ为常数；应用前提条件（1）稀溶液；（2）溶质对溶剂互溶没有影响；（3）必须是同一分子类型，不发生缔合或离解。第83页/共170页84‹#›分配定律推导当温度一定时，标准化学位为常数如为稀溶液，用浓度代替活度根据相律（F=C-P+2），在一定温度和压力下萃取达到平衡时，溶质在两相中的化学位相等：μL=μH第84页/共170页85‹#›弱电解质在有机溶剂-水相的分配平衡分配系数中CL和CH

必须是同一种分子类型，即不发生缔合或离解。对于弱电解质，在水中发生解离，则只有两相中的单分子化合物的浓度才符合分配定律。

例如青霉素在水中部分离解成负离子（青COO－），而在溶剂相中则仅以游离酸（青COOH）的形式存在，则只有两相中的游离酸分子才符合分配定律。此时，同时存在着两种平衡，一种是青霉素游离酸分子在有机溶剂相和水相间的分配平衡；另一种是青霉素游离酸在水中的电离平衡。前者用分配系数K0来表征，后者用电离常数Kp来表征。对于弱碱性物质也有类似的情况。

第85页/共170页86‹#›青霉素的分配平衡第86页/共170页87‹#›分离因素（β）如果原来料液中除溶质A以外，还含有溶质B，则由于A、B的分配系数不同，萃取相中A和B的相对含量就不同于萃余相中A和B的相对含量。如A的分配系数较B大，则萃取相中A的含量（浓度）较B多，这样A和B就得到一定程度的分离。萃取剂对溶质A和B分离能力的大小可用分离因素（β）来表征。第87页/共170页88‹#›分离因素表示有效成分A与杂质B的分离程度。ＫＡ

β=ＫＢ

β=1KA=KB

分离效果不好；β>1KA>KB

分离效果好；β越大，KA

越大于KB，分离效果越好。分离因素（β）第88页/共170页89‹#›2、有机溶剂的选择选择原则：根据相似相溶的原理(最重要参数：介电常数，极性)，选择与目标产物性质相近的萃取剂，可以得到较大分配系数。此外，有机溶剂还应满足以下要求：1)、价廉易得；2)、与水相不互溶；3)、与水相有较大的密度差，并且粘度小，表面张力适中，相分散和相分离较容易；第89页/共170页90‹#›4)、容易回收和再利用；5)、毒性低，腐蚀性小，闪点低，使用安全；6)、不与目标产物发生反应。常用于抗生素类萃取剂有：丁醇等醇类、乙酸乙酯、乙酸丁酯和乙酸戊酯等乙酸酯类以及甲异丁基甲酮等。第90页/共170页91‹#›

3．水相条件的影响

发酵液中存在与产物性质相近的杂质、未完全利用的底物、无机盐、供微生物生长代谢的其他营养成分等。必须考虑这些物质对萃取过程的影响。(1)pH值

直接影响表观分配系数。对选择性有影响。

pH值还应尽量选择在使产物稳定的范围内。第91页/共170页92‹#›2.温度T

◆温度会影响生化物质的稳定性，所以一般在室温或低温下进行。T↑，分子扩散速度↑，故萃取速度↑

◆

T影响分配系数例：pen―T↑水中的溶解度↑∴萃取时T↓使K↑；红霉素、螺旋霉素―T↑水中的溶解度↓

∴萃取时T↓使K↑；反萃时T↑使K反↑◆

T影响两溶剂的互溶度影响；第92页/共170页93‹#›3.盐析：一方面，盐析剂硫酸铵、氯化钠等可使产物在水中溶解度降低，而易于转入溶剂中去。另一方面，也能减少有机溶剂在水中溶解度。但过多可能促使杂质一起转入溶剂相，必要时要考虑回收。例：pen从水相→丁酯中，加氯化钠洗涤，消除有机相水滴，提高质量和收率；

spm的丁酯萃取液+饱和盐水洗涤，减少spm在水中溶解度；消除有机相水滴；分相容易。第93页/共170页94‹#›

4、带溶剂能和产物形成复合物，使产物更易溶于有机溶剂相中，提高分配系数。复合物又要容易分解。对于水溶性强的溶质，可利用脂溶性萃取剂与溶质间的化学反应生成脂溶性复合分子，使溶质向有机相转移。①抗生素萃取剂：月桂酸、脂肪碱或胺类等。②氨基酸萃取剂：氯化三辛基甲铵。溶质与带溶剂之间的作用：离子对萃取、离子交换萃取、反应萃取。第94页/共170页95‹#›萃取百分率

萃取百分率：被萃取物在有机相中的量占它在两相中的百分数。第95页/共170页96‹#›萃取效率

设：萃取体系中水相的体积为V水，有机相的体积为V有，则萃取效率可从下式计算：第96页/共170页97‹#›对萃取效率公式的讨论1．当V(水)＝V(有)，即用与试液同体积的有机溶剂来率取，此时上式为：2．当V(水)＝V(有)，而D＝1时，则萃取一次萃取效率为50%；3．若要求萃取百分率大于90%，则D必须大于9；4．当分配比不够大时，一次萃取的效率不达要求，可采用多次萃取的方法来提高萃取效率。第97页/共170页98‹#›多次连续萃取的计算设V（水）为水相体积，V（有）为每次加入的有机相体积，m0为被萃取前试样中A的质量，m1、m2、……mn为1次、2次……n次萃取后水相中剩余的A的质量，求m1、m2、……mn？解:经一次萃取后留在水相中A的质量第98页/共170页99‹#›第二次萃取后水相中剩余溶质质量：经n次萃取后水相中剩余溶质质量：n次萃取后的萃取效率E为：第99页/共170页100‹#›

以CCl4萃取20mL水溶液中的I2，已知碘在水与CCl4的分配比为85，试比较用20mLCCl4一次萃取及每次用10mLCCl4分两次萃取的萃取效率。解：一次萃取：分两次萃取：第100页/共170页101‹#›3.6双水相萃取技术

溶液的分相不一定完全依赖于有机溶剂，在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。第101页/共170页102‹#›1、双水相的形成当两种聚合物互相混合时，究竟是否分层或混合成一相，取决于两种因素：一体系熵的增加，二分子间作用力。

熵的增加涉及到分子数量，与分子大小无关。当分子的物质的量相同时，大分子与小分子间的混合，熵的增加是相同的。分子间的作用力可看作分子中各基团间相互作用力之和。分子量越大，分子间的作用力也越大。大分子间混合，分子间作用力决定混合效果。混合分子间如存在空间排斥力，它们的基团结构无法互相渗透，则在达到平衡后就有可能分成两相，形成双水相。第102页/共170页103‹#›将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物浓度达到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这就是双水相体系.形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。另外，某些聚合物的溶液与某些无机盐的溶液相混合时，只要浓度达到一定值，也会形成两相，即聚合物—盐双水相体系，成相机理尚不清楚。第103页/共170页104‹#›第104页/共170页105‹#›常用的双水相体系

高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)和PEG/Dextran

高聚物/无机盐体系：常见的高聚物/无机盐体系为:PEG/硫酸盐或磷酸盐体系。第105页/共170页106‹#›2、相图两水相的形成条件和定量关系常用相图表示。相图是一条双节线。双节线下方为均匀区，双节线上方即为两相区，两相分别有不同的组成和密度。上相组成用T(Top)表示，下相组成用B(Bottom)表示。由图7-2可知，上相主要含PEG，下相主要含Dex。第106页/共170页107‹#›（1）聚合物及其分子量的影响

不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水性，水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:

葡萄糖硫酸盐<甲基葡萄糖<葡萄糖<羟丙基葡聚糖<甲基纤维素<聚乙烯醇<聚乙二醇<聚丙三醇。3、影响物质分配平衡的因素第107页/共170页108‹#›

同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加，其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向，在PEG/DEX系统中，蛋白质的分配系数随着DEX相对分子量的增加而增加。若想在上相获得较高的蛋白质收率，对于PEG聚合物，应降低它的平均分子量，相反，若想在下相获得较高的蛋白质收率，则平均分子量应增加。第108页/共170页109‹#›（2）pH值的影响

改变两相的电位差；如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大，则蛋白质在两相中分配越不均匀。

pH值的变化也会导致组成体系的物质电性发生变化，也会使被分离物质的电荷发生改变，从而影响分配的进行。第109页/共170页110‹#›（3）离子环境对蛋白质在两相体系分配的影响在双水相聚合物系统中，加入电解质时，其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时，由于电中性的约束,存在一穿过相界面的电势差,它是影响荷电大分子如蛋白质和核酸等分配的主要因素。同样，对于粒子迁移也有相似的影响，粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电势，就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。第110页/共170页111‹#›（4）温度的影响

分配系数对温度的变化不敏感；成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4℃)低,有助于相的分离并节省了能源开支。第111页/共170页112‹#›双水相萃取技术的特点(1)系统含水量多达75%～90%,两相界面张力极低(10-7～10–4N·m-1),有助于保持生物活性和强化相际间的质量传递。(2)分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有5～15min。(3)双水相分配技术易于连续化操作。第112页/共170页113‹#›(4)目标产物的分配系数一般大于3,大多数情况下,目标产物有较高的收率。(5)大量杂质能够与所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去1～2个分离步骤,使整个分离过程更经济。(6)设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶剂残留问题。第113页/共170页114‹#›双水相萃取的工艺流程双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。第114页/共170页115‹#›

双水相萃取技术目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。要成功地运用双水相萃取法，应满足下列条件：

(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中；

(2)酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时，经过一次萃取，就能得到较高的收率；

(3)两相用离心机很容易分离。第115页/共170页116‹#›双水相的应用举例1.分离和提纯各种蛋白质(酶）

用PEG/-(NH4)2SO4

双水相体系,经一次萃取从α-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。蛋白酶在水相中的收率高于60%。第116页/共170页117‹#›2.提取抗生素和分离生物粒子

采用PEG/Na2HPO4

体系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取条件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),丙酰螺旋霉素收率达69.2%。第117页/共170页118‹#›双水相和其他方法的集成1、与生物转化的集成；2、与膜分离技术的集成；3、与温度诱导相分离的集成；4、与亲和萃取的集成；5、与亲和沉淀的集成；6、与电泳技术的集成；7、磁场与双水相分离；8、超声波与双水相分配。第118页/共170页119‹#›3.7膜分离法

膜分离法实际上是一般过滤法的发展和延续。一般过滤法不是分子级水平的，它是利用相的不同将固体从液体或气体中分离出来；而膜分离是分子级水平的分离方法，该法关键在于过程中使用的过滤介质：膜。

膜必须是半透膜，既能透过某种物质，而阻碍另一种物质。膜过滤通常在常温下操作，不含相的变化，这对出来热敏感的物质如食品、制药等工业和生物产品尤为重要。第119页/共170页120‹#›

所谓的膜，是指在一种流体相内或是在两种流体相之间有一层薄的凝聚相，它把流体相分隔为互不相通的两部分，并能使这两部分之间产生传质作用。

膜的特性：◆不管膜多薄,它必须有两个界面。这两个界面分别与两侧的流体相接触◆膜传质有选择性，它可以使流体相中的一种或几种物质透过，而不允许其它物质透过。膜是什么？有何特性？第120页/共170页121‹#›膜分离过程原理：以选择性透膜为分离介质，通过在膜两边施加一个推动力（如浓度差、压力差或电压差等）时，使原料侧组分选择性地透过膜，以达到分离提纯的目的。通常膜原料侧称为膜上游，透过侧称为膜下游。膜上游透膜膜下游选择性透膜第121页/共170页122‹#›膜分离法的分类及原理

透析、超滤及反渗透、微滤、电渗析、液膜技术等。1、透析利用具有一定孔径大小亲水膜，高分子溶质不能透过，将含有高分子溶质和其他小分子溶质的溶液（左侧）与纯水或缓冲液（右侧）分隔，由于膜两侧的溶质浓度不同，在浓差的作用下，左侧高分子溶液中的小分子溶质透向右侧，右侧中的水透向左侧，这就是透析。第122页/共170页123‹#›2008-4-222、超滤和微滤超滤和微滤都是利用膜的筛分性质，以压差微为推动力，用于截留高分子溶质或固体微粒。超滤：处理不含固形成分的料液，它是根据高分子溶质间或高分子与小分子溶质之间相对分子质量的差别机械分离的方法.微滤：用于悬浮粒的过滤，主要用于菌体的分离和浓缩。第123页/共170页124‹#›3、反渗透促使水分子透过的推动力称为渗透压。操作压力：几十个大气压适用于1nm以下小分子的浓缩。4、电渗析利用分子的荷电性质分子大小的差别进行分离的膜分离法，可用于小分子电解质（例如氨基酸、有机酸）的分离和溶液的脱盐。第124页/共170页125‹#›2008-4-223.14结晶物质有结晶和无定形两种状态，区别在于，构成单位的排列方式是否规则。结晶：析出速度慢，溶质分子有足够时间进行排列，粒子排列有规则。无定形固体：析出速度快，粒子排列无规则-沉淀。利用可溶物质的溶解性及其受温度变化影响不同，使溶质以晶体状态从溶液中析出的过程。第125页/共170页126‹#›

结晶是制备纯物质的有效方法，具有高度的选择性。只有同类分子或离子才能排列成晶体，因此结晶过程有良好的选择性。通过结晶，溶液中大部分的杂质会留在母液中，再通过过滤、洗涤，可以得到纯度较高的晶体。结晶过程具有成本低、设备简单、操作方便，广泛应用于氨基酸、有机酸、抗生素、维生素、核酸等产品的精制。第126页/共170页127‹#›

大多数物质结晶都是在溶液中进行的，所以形成的晶体中常含有一定量的结晶水。晶体的含水量与晶体蒸汽压强有关，当晶体蒸汽压强高于大气蒸汽压强时，则风化失去结晶水。

晶体与非晶体的主要区别在于晶态物质的许多性质如光学和电学都具有方向性，即在同一方向上具有相同的性质，在不同方向上具有相异性（称为晶体各向相异性）；非晶体则不具此性质。晶体是具有一定形状的固态物质，由许多性质相同的粒子（原子、离子和分子）有规律地排列而成。第127页/共170页128‹#›1、结晶过程的基本原理

饱和溶液：当溶液的浓度等于该溶质在同等条件下的溶解度时，该溶液称为饱和溶液；

过饱和溶液：溶质浓度超过饱和溶解度时，该溶液称之为过饱和溶液；

溶解度和温度有关，一般物质的溶解度都随温度的升高而增加。但有少数例外，红霉素在水中的溶解7℃时为14.2mg/ml，而在40℃时则降为1.28mg/ml。第128页/共170页129‹#›C*---小晶体的溶解度；

C---颗粒半径为r的溶质溶解度σ---固体颗粒与溶液间的界面张力；ρ---晶体密度R---气体常数；

T---绝对温度凯尔文公式颗粒大小与溶解度的关系式溶解度还和溶质颗粒的大小有关，微小颗粒的溶解度要比正常颗粒大。第129页/共170页130‹#›结晶过程的实质

结晶是指溶质自动从过饱和溶液中析出，形成新相的过程。这一过程不仅包括溶质分子凝聚成固体，还包括这些分子有规律地排列在一定晶格中，这一过程与表面分子化学键力变化有关；因此，结晶过程是一个表面化学反应过程。

因要形成新的表面，就需要对表面张力做功。因此溶质浓度达到饱和浓度时，还不能使晶体析出，当浓度超过饱和浓度一定的过饱和程度时，才有晶体析出。第130页/共170页131‹#›晶体的形成首先形成晶核，由Kelvin公式，微小的晶核与正常晶体相比具有较大的溶解度。实质上，在饱和溶液中，晶核是处于一种形成—溶解—再形成的动态平衡之中，只有达到一定的过饱和度以后，晶核才能够稳定存在。这就是为什么溶液浓度必须达到一定的过饱和程度时才能结晶的原因。最先析出的微小颗粒是作为以后晶体的中心，微小颗粒称为晶核。大小通常在几个纳米至几十微米。第131页/共170页132‹#›

过饱和度S：过饱和程度通常用过饱和溶液的浓度与饱和浓度之比S来表示。晶体的形成过程：1、过饱和溶液的形成2、晶核的形成3、晶体生长其中，溶液达到过饱和状态是结晶的前提；过饱和度是结晶的推动力。第132页/共170页133‹#›2008-4-22溶解度与温度的关系可以用饱和曲线和过饱和曲线表示实线代表饱和曲线，虚线代表过饱和曲线温度ABCDE不稳区介稳区稳定区第133页/共170页134‹#›2008-4-22稳定区(不饱和区)：不会发生结晶；不稳定区(过饱和区)：结晶能自动生成；介稳区：结晶不能自动进行。向处于介稳区的溶液中加入晶体，能诱导结晶产生，晶体能生长。第134页/共170页135‹#›结晶过程1、晶核形成与晶体生长

溶质从溶液中结晶出来，需经历两个阶段，即晶核的生成（成核）和晶体的成长。晶核的形成（1）过饱和溶液的形成结晶的首要条件是过饱和，制备过饱和溶液一般有四种方法。A、将饱和溶液冷却B、将部分溶剂蒸发C、化学反应结晶D、盐析结晶第135页/共170页136‹#›1、热饱和溶液冷却（等溶剂结晶）

适用于溶解度随温度升高而增加的体系；同时，溶解度随温度变化的幅度要适中；先加热使其溶解，然后冷却结晶；

自然冷却、间壁冷却（冷却剂与溶液隔开）、直接接触冷却（在溶液中通入冷却剂）2、部分溶剂蒸发法（等温结晶法） 适用于溶解度随温度降低变化不大的体系，或随温度升高溶解度降低的体系；加压、减压或常压蒸馏第136页/共170页137‹#›3、化学反应结晶 加入反应剂产生新物质，当该新物质的溶解度超过饱和溶解度时，即有晶体析出。其方法的实质是对待结晶的物质进行修饰，可以调节其溶解特性。如在青霉素醋酸丁酯提取液中，加入乙醇-醋酸钾，因形成的青霉素钾盐难溶于醋酸丁酯而结晶析出。4、盐析结晶

加入能使结晶溶质溶解度降低的物质，让结晶溶质形成过饱和液而结晶的方法。常用的沉淀剂：固体氯化钠、甲醇、乙醇、丙酮。例如卡那霉素不溶于乙醇，向卡那霉素脱色液中加入终浓度为60%-80%的乙醇，就结晶析出;在普鲁卡因青霉素结晶时，加入一定量的食盐，可使结晶更易析出。第137页/共170页138‹#›晶核的形成

晶核的形成是一个新相产生的过程，需要消耗一定的能量才能形成固液界面；结晶过程中，体系总的自由能变化分为两部分，即：表面过剩吉布斯自由能（ΔGs）和体积过剩吉布斯自由能（ΔGv）；晶核的形成必须满足：ΔG=ΔGs+ΔGv<0通常ΔGs>0，阻碍晶核形成；第138页/共170页139‹#›临界半径与成核功假定晶核形状为球形，半径为r，则ΔGv=4/3(πr3ΔGv)；若以σ代表液固界面的表面张力，则ΔGs=4πr2σ；因此，在恒温、恒压条件下，形成一个半径为r的晶核，其总吉布斯自由能的变化为：ΔG=4πr2(σ+(r/3)ΔGv)ΔGv—形成单位体积晶体的吉布斯自由能变化第139页/共170页140‹#›临界半径（rc）临界晶核半径是指ΔG=4πr2(σ+(r/3)ΔGv)为最大值时的晶核半径；r<rc

时，ΔGs占优势，故ΔG>0，晶核不能自动形成；r>rc

时，ΔGv占优势，故ΔG<0，晶核可以自动形成，并可以稳定生长；rc

称为临界半径。r<rc晶体自动溶解；r＞rc晶体自动生长。第140页/共170页141‹#›晶核的成核速度成核速度：单位时间内在单位体积溶液中生成新核的数目。成核速度大：导致细小晶体生成，因此，需要避免过量晶核的产生。影响成核速度的因素：1、过饱和度当过饱和度超过某一值时，成核速度增加很快。2、黏度黏度大时，分子运动减慢，成核速度降低。第141页/共170页142‹#›3、温度

一般成核速度随温度上升，达到