发酵学培养基

发酵学培养基第1页，共68页，2023年，2月20日，星期三第一节概述第二节培养基的成分第三节培养基的种类与选择第四节影响培养基质量的因素第2页，共68页，2023年，2月20日，星期三一、培养基的定义二、配制工业发酵培养基的一般要求第一节概述第3页，共68页，2023年，2月20日，星期三培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物。一、培养基的定义分批发酵工艺：菌种发芽生长扩大菌体繁殖发酵罐内的菌体生长产物合成培养基的优劣影响菌体繁殖产物的合成产品的分离精制产品的产量和质量第4页，共68页，2023年，2月20日，星期三碱性培养基中：产黄青霉菌的菌丝体短而粗，易成球状体。培养基中加海藻酸或甲基纤维素能诱发产黄青霉菌和黑曲霉菌的菌丝体呈丝状体生长。二价阳离子促进菌丝体呈球状，用阴离子聚合物可以阻止二价阳离子的影响。柠檬酸发酵中（黑曲霉菌）和衣康酸发酵中（土曲霉菌），菌丝体为球状体时的产酸最高，而产黄青霉菌发酵青霉素时，丝状体时的产量最高。生物素改变细胞膜的通透性，减少反馈抑制。（谷氨酸发酵）青霉素抑制G＋菌细胞壁形成，而改变细胞的通透性。表面活性剂改变细胞的通透性。（酶制剂发酵）第5页，共68页，2023年，2月20日，星期三二、配制工业发酵培养基的一般要求1.营养物质组成丰富、浓度适当。2.在一定条件下，各种材料间不能产生生化反应，理化性质相对稳定。3.粘度适中，具有适当的渗透压4.

主产物合成达到最高速率，发酵后所形成的副产物尽可能的少。5.生产过程中既不影响通气与搅拌的效果，又不影响或少影响产物的分离精制和废物处理。6.大规模生产时要考虑材料的成本。第6页，共68页，2023年，2月20日，星期三第二节培养基的成分碳源氮源无机离子促进剂和抑制剂水分生长因子前体第7页，共68页，2023年，2月20日，星期三一、碳源

凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质均称为碳源。它既是构成菌体细胞和代谢产物的主要元素，又是提供微生物生命活动中所需能源的原料。第8页，共68页，2023年，2月20日，星期三葡萄糖：葡萄糖、淀粉水解液蔗糖：甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、粗红糖、精白糖、乳糖：纯乳糖、乳清粉淀粉：大麦、大米、燕麦粉、黑麦粉、玉米、野生植物、薯类等工业常用的碳源还有脂肪、有机酸和醇、烃类化合物、食品工厂的下脚料等。糖类第9页，共68页，2023年，2月20日，星期三糖蜜糖蜜是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。糖蜜主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜。除糖份外，含有较多的杂质，其中有些是有用的，但是许多都会对发酵产生不利的影响，需要进行预处理。例：谷氨酸发酵有害物质：胶体成分（起泡、结晶）、钙盐（结晶）生物素（发酵控制）预处理：澄清→脱钙→脱除生物素例：柠檬酸发酵有害物质：铁离子含量高（导致异柠檬酸的生成）预处理：→黄血盐第10页，共68页，2023年，2月20日，星期三淀粉用于抗生素、氨基酸、核苷酸、有机酸、醇、酶制剂等发酵生产优点：来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。缺点：难利用。微生物必须能分泌水解淀粉的酶类发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶第11页，共68页，2023年，2月20日，星期三脂肪霉菌和放线菌可以用脂肪作为碳源。发酵过程中加油脂主要是用于消沫和补充碳源。利用油脂作碳源需要大量的氧，供氧不充分易产生过量有机酸而降低pH值，且油脂贮藏过程易酸败。

第12页，共68页，2023年，2月20日，星期三有机酸、醇

主要在单细胞蛋白、氨基酸、维生素和某些抗生素的发酵生产中作为碳源。甘油是最常用的补充碳源，常用于抗生素和甾体转化的发酵中，而山梨醇是生物Vc的重要中间体。第13页，共68页，2023年，2月20日，星期三碳氢化合物（各种烃类）

多为各种石油产品，已在单细胞蛋白、氨基酸、核甘酸、有机酸、维生素、酶类、糖类、某些抗生素发酵中应用。最常用效果最好是正十六烷。裂烃棒状菌RT的抗青霉素突变株用正十六烷生产谷氨酸，可达每升84g/L。用正十六烷和正十四烷生产α-酮戊二酸、柠檬酸、VB12等。常用的烃有甲烷、乙烷、丁烷、C12-C20等各种烷烃。第14页，共68页，2023年，2月20日，星期三二、氮源

是指构成微生物细胞和代谢产物中的氮素的营养物质。其主要功能是构成微生物菌体的细胞物质（如氨基酸、蛋白质、核算等）和含氮的代谢产物。主要分为有机氮源和无机氮源。第15页，共68页，2023年，2月20日，星期三含有丰富的蛋白质、肽类、游离的氨基酸含有少量的糖类、脂肪、无机盐和生长因子等。1.有机氮源：蛋白胨：多由动物组织或植物水解制备黄豆饼粉：全脂、低脂、脱脂三类棉籽饼粉：低温提取油脂、高温提取油脂，青霉素生产等玉米浆：玉米淀粉生产的副产物，干玉米浆和液态玉米浆，含可溶性蛋白、生长因子（生物素），硫、磷、微量元素等酵母粉：含蛋白质，氨基酸、维生素等，来自啤酒酵母和面包酵母尿素：相对单一，流加时温度不宜过高，否则游离氨过多，使pH升高，一般在培养基冷却后加入。第16页，共68页，2023年，2月20日，星期三成分复杂：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。例玉米浆：①可溶性蛋白、生长因子（生物素）、苯乙酸②较多的乳酸③硫、磷、微量元素等第17页，共68页，2023年，2月20日，星期三有机氮源成分复杂可以从多个方面对发酵过程进行影响，而另一方面有机氮源的来源具有不稳定性。所以在有机氮源选取时和使用过程中，必须考虑原料的波动对发酵的影响，经常需要摇瓶小试。第18页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.无机氮源铵盐中的氮与细胞中的有机氮化合物中的氮处于相同的氧化水平，可被菌体直接吸收利用。硝酸盐中的氮原子必先还原成氨后，才能被菌体吸收利用。铵盐、硝酸盐和氨水：成分单一，质量较稳定第19页，共68页，2023年，2月20日，星期三特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化如：生理酸性物质生理碱性物质所以选择合适的无机氮源有两层意义：满足菌体生长稳定和调节发酵过程中的pH第20页，共68页，2023年，2月20日，星期三三、无机盐和微量元素磷、硫、铁、镁、钙、锌、钴、钾、钠、锰、氯等，低浓度时常呈刺激作用，而高浓度时常表现抑制作用。无机盐类是微生物生命活动所不可缺少的物质。主要功用是：①构成菌体成分；②作为酶活性基团的组成部分或维持酶的活性；③调节渗透压、pH值、氧化还原电位等；第21页，共68页，2023年，2月20日，星期三磷：是构成菌体核酸、核蛋白等细胞质的组成成分，是许多辅酶和高能磷酸键的成分，又是氧化磷酸化反应的必需元素。硫：含硫氨基酸（胱氨酸，半胱氨酸，蛋氨酸等）的组成部分，辅酶的活性基。钠、钾、钙：可维持细胞渗透压，可调节细胞透性，一些酶的激活剂。镁：激活一些酶活性。铁：是菌体的细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素。过量可降低抗生素的产量。（青霉素发酵）锌：是链霉素发酵的必需元素，微量的锌能促进链霉素、青霉素的发酵。钴：是VB12组成元素之一，适量可提高产量。第22页，共68页，2023年，2月20日，星期三A.对于其它渠道有可能带入的过多的某种无机离子和微量元素在发酵过程中必须加以考虑例：铁离子：青霉素发酵中，铁离子的浓度要小于20μg/ml

发酵罐必须进行表面处理注意事项B、使用时注意盐的形式（pH的变化）例：黑曲酶NRRL-330,生产α-淀粉酶，P对酶活的影响

pH酶活不加4.25120分钟加K2HPO45.4530分钟加KH2PO44.6275分钟第23页，共68页，2023年，2月20日，星期三

从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

四、生长因子

如谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子第24页，共68页，2023年，2月20日，星期三一些维生素生长因子及其生理功能维生素生理功能维生素B1（硫胺素）脱羧酶辅酶，与酮基转移有关维生素B2（核黄素）构成黄素单核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸，作为电子传递链中的递H体维生素B3（泛酸）辅酶A（CoA）的前体物质之一，递酰基体，是细胞内多种酶的辅酶维生素B5（烟酸）又称尼克酸，是辅酶I，辅酶II的前体，参与细胞内很多氧化还原反应维生素B6（吡哆醇）其磷酸酯是转氨辅酶，也与氨酸酸消旋和脱羧有关维生素B11（叶酸）构成四氢叶酸，传递各种C1分子维生素B12（钴胺素）变位酶辅酶维生素H（生物素）硫辛酸羧化酶辅酶，在脂肪酸代谢中有重要作用递酰基体，常与CoA、VB1协同作用第25页，共68页，2023年，2月20日，星期三如合成青霉素G的苯乙酸五、前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，其自身结构并无多大变化，但产物产量却因前体的加入有较大提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136第26页，共68页，2023年，2月20日，星期三浓度过高，则对菌体的生长有毒副作用。前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化。流加也有利于提高前体的转化率用法：前体使用时普遍采用流加的方法

一般基础料中仅仅添加0.07%。Why？第27页，共68页，2023年，2月20日，星期三几种常见的前体产物前体产物前体青霉素G苯乙酸等维生素B12钴化物青霉素O烯丙基-巯基乙酸丝氨酸甘氨酸青霉素V苯氧乙酸色氨酸吲哚、氨茴酸链霉素肌醇、精氨酸等蛋氨酸2-羟基-4-甲基硫代丁酸金霉素氯化物等异亮氨酸D-苏氨酸红霉素丙酸、丙醇等苏氨酸高丝氨酸灰黄霉素氯化物第28页，共68页，2023年，2月20日，星期三六、产物促进剂所谓产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。第29页，共68页，2023年，2月20日，星期三促进剂提高产量的机制：有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产，也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。第30页，共68页，2023年，2月20日，星期三

有些抑制剂可抑制某些合成产物的途径而使代谢向所需产物的途径转化，常常被用在抗生素和有机溶剂发酵中。氯霉素、植酸、草酸等能抑制噬菌体的繁殖，可用于氨基酸发酵。七、抑制剂第31页，共68页，2023年，2月20日，星期三发酵工业常用的抑制剂产物被抑制产物抑制剂链霉素甘露糖链霉素甘露聚糖去甲基链霉素链霉素乙硫氨酸四环素金霉素溴化物、硫脲去甲基金霉素金霉素硫磺化合物、乙硫氨酸头孢菌素C头孢霉素NL-蛋氨酸利福霉素B其他利福霉素巴必妥药物甘油乙醇亚硫酸盐第32页，共68页，2023年，2月20日，星期三八、水分水源质量的主要考虑参数包括pH值、溶解氧、可溶性固体、污染程度以及矿物质组成和含量。水是良好的溶剂，菌体所需要的营养物质都是溶解于水中被吸收的。渗透、分泌、排泄等作用都是以水为媒介的；水直接参与代谢作用中的许多反应。所以，水在生物化学反应中占有极为重要的地位。水的比热高，能有效地吸收代谢过程中所放出的热，使细胞内温度不致骤然上升。水是热的良导体，有利于放热，可调节细胞的温度。第33页，共68页，2023年，2月20日，星期三九、消沫剂工业发酵中常用一些消沫剂消除发酵中产生的泡沫，保证生产的正常运行。常用的消沫剂有植物油脂、动物油脂和一些化学合成的高分子化合物。第34页，共68页，2023年，2月20日，星期三第三节培养基的种类与选择一、培养基的种类按生产目的和过程分为：孢子培养基、种子培养基和发酵培养基按组成成分：复合培养基、合成培养基按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按用途：选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基、原生质体再生培养基、抗生素生物效价检测用的生物检测培养基等。第35页，共68页，2023年，2月20日，星期三(一)孢子培养基用途：供制备孢子用。要求：能使孢子迅速发芽和生长，能形成大量的优质孢子，但不能引起菌种变异。注意事项：基质浓度（特别是有机氮源）要低些，无机盐浓度要适量。

孢子培养基成分因菌不同而异，常用的有麸皮培养基、大（小）米培养基、琼脂斜面培养基等。第36页，共68页，2023年，2月20日，星期三

用途：供孢子发芽和菌体生长繁殖用。

要求：营养成分是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完整，其中氮源和维生素的含量应略高些，但总浓度以略稀薄为宜，以便菌体的生长繁殖。

常用原料：因菌不同而不同，常用的有葡萄糖、糊精、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、硫酸铵、尿素、硫酸镁、磷酸盐等。

(二)种子培养基第37页，共68页，2023年，2月20日，星期三种子培养基特点：1.必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子。2.种子培养基中各种营养物质的浓度不必太高。供孢子发芽生长用的种子培养基，可添加一些易被吸收利用的碳源和氮源。3.种子培养基成分还应考虑与发酵培养基的主要成分相近。第38页，共68页，2023年，2月20日，星期三(三)发酵培养基用途：供菌体生长繁殖和合成大量代谢产物用的要求：营养成分和粘度适中，同时考虑各种生化代谢过程，产物合成期pH值等条件不易发生大的变动，也不能影响产物的分离提纯。

发酵培养基是发酵生产中最主要的培养基，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。设计时应慎重考虑。第39页，共68页，2023年，2月20日，星期三二、培养基的设计和筛选1.确定培养基的组成

碳源、氮源、pH、生长因子、前体、促进剂、泡沫、原材料2.确定培养基成分的基本配比和浓度

C、N浓度及比例，生理酸碱性物质比例、无机盐浓度等3.培养基的筛选单因素、正交试验、均匀试验设计、响应面法等第40页，共68页，2023年，2月20日，星期三三、培养基设计的注意事项1.pH的控制在微生物培养过程中加入酸或碱或流加某些营养物质调节培养基的pH；注意有些营养物质被利用后培养基的pH变化情况.控制pH最常用的方法是在培养基中添加具有一定缓冲能力的物质作为营养物，如以磷酸盐作为磷的成分；或者避免使用容易产生生理酸性或碱性成分，使培养基pH波动太大的物质。第41页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.避免产生微生物不能利用的物质或形成沉淀葡萄糖与铵盐或氨基酸的氨基在灭菌高温下作用形成深褐色物质。这种物质不被微生物利用。因此这两类营养物不宜直接配在一起进行灭菌，而应采用分开灭菌后再加入发酵罐内。硫酸铵中的SO42-与钙盐易形成难溶的硫酸钙，因此二者也不宜直接配成培养基。第42页，共68页，2023年，2月20日，星期三3.注意代谢调节物的影响：有些物质存在于培养基中往往能明显地促进或抑制发酵产物的形成。例如：前体物质、诱导剂、阻遏物、抑制剂、金属离子第43页，共68页，2023年，2月20日，星期三第四节影响培养基质量的因素一、原材料质量的影响有机氮源：加工用的原材料品种、产地、加工方法和储存条件。（黄豆饼粉、玉米浆、蛋白胨等）碳源：淀粉、葡萄糖和乳糖-不同的原料、产地、加工方法油脂：原料（豆油、玉米油、米糠油、杂鱼油）以及储藏条件和时间的影响

质量控制：监测各种有机氮源中的蛋白质、磷、脂肪和水分的含量，注意酸价变化；重视储藏温度和时间无机盐和前体物第44页，共68页，2023年，2月20日，星期三二、水质的影响大生产中使用的水有深井水、自来水、地表水和蒸馏水。含有的无机离子和有机物的含量不同。措施：定期检测水质，地表水应经过适当的处理第45页，共68页，2023年，2月20日，星期三三、灭菌的影响工业发酵中常采用饱和蒸汽灭菌方法杀灭培养基中的有机体。糖类（还原糖）与氨基酸（赖氨酸）、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热，会产生化学反应，形成5-甲基糠醛和棕色的类黑精；糖类还能与磷酸盐产生络合反应，形成棕色色素；措施：将糖与其他物质分别灭菌第46页，共68页，2023年，2月20日，星期三四、其他影响因素pH值：改变营养物质的浓度比例，尤其是生理酸碱性物质的用量来调节培养基pH值为主，用酸碱调节为辅。培养基粘度：为保证灭菌质量，尽量使培养基液体化第47页，共68页，2023年，2月20日，星期三概念培养基生理酸性物质生理碱性物质生长因子前体第48页，共68页，2023年，2月20日，星期三要点1.培养基的组成要素2.配制工业发酵培养基的一般要求3.培养基的种类4.影响培养基质量的因素第49页，共68页，2023年，2月20日，星期三根据原料淀粉的性质和水解使用的催化剂的不同酸解法（acidhydrolysisprocess)

水解的方法酶解法(enzymatic

hydrolysis

process)

酸酶结合法(acid-enzymatichydrolysis)补充内容：淀粉水解糖的制备在工业生产中，将淀粉水解为葡萄糖（glucose）的过程称淀粉的糖化，制得的溶液叫淀粉水解糖。第50页，共68页，2023年，2月20日，星期三

一、淀粉水解制糖的意义大多数微生物不能直接利用淀粉（所有的氨基酸生产菌不能直接利用）2.有些微生物能够直接利用淀粉作原料，但必须在微生物产生淀粉酶后才能进行，过程缓慢，发酵周期延长。3.若直接利用淀粉作原料，灭菌过程的高温会导致淀粉结块，发酵液粘度剧增。第51页，共68页，2023年，2月20日，星期三二、淀粉水解糖的制备方法及原理（一）酸解法（acidhydrolysismethod）以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。

第52页，共68页，2023年，2月20日，星期三1.水解过程：总反应式：(C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6过程：(C6H10O5)n(C6H10O5)xC12H22O11C6H12O6

淀粉糊精麦芽糖葡萄糖

H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。第53页，共68页，2023年，2月20日，星期三2.葡萄糖的复合反应和分解反应在水解过程中，由于受到酸和热的作用，一部分葡萄糖会发生复合反应和分解反应。第54页，共68页，2023年，2月20日，星期三

淀粉

葡萄糖复合二糖5‘－羟甲基糠醛复合低聚糖有机酸、有色物质损失葡萄糖量

7％<1％复合反应分解反应盐酸第55页，共68页，2023年，2月20日，星期三不利影响：（1）降低了葡萄糖的收率。（2）给产物的提取和糖化液的精制带来困难。复合反应：生成的多数复合糖不能被微生物利用，使发酵结束时残糖高。分解反应：生成的5‘－羟甲基糠醛是产生色素的根源，增加了糖化液精制脱色的困难。第56页，共68页，2023年，2月20日，星期三如何控制分解反应和复合反应的发生？（1）淀粉乳浓度（2）酸浓度不能过高（3）温度第57页，共68页，2023年，2月20日，星期三

3.评价优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。缺点：（1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90％左右。（2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。第58页，共68页，2023年，2月20日，星期三DE值：dextroseequivalentvalue

（葡萄糖当量值）表示淀粉糖的含糖量。还原糖含量（％）DE值＝

100％干物质含量（％）第59页，共68页，