医疗器械检化员微生物培训

医疗器械检化员微生物培训第1页，共97页，2023年，2月20日，星期四一、人员资质及培训要求

从事医疗器械微生物检验工作的人员应具备微生物学或相近专业知识的教育背景。检验人员应依据所在岗位和职责接受相应的培训，在确认它们可以承担某一检验前，他们不能独立从事该项微生物检验。应保证所有人员在上岗前接受胜任工作所必须的设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级别试验人员的继续教育计划。检验人员必须熟悉相关监测方法、程序、检验目的和结果评价。微生物实验室的管理者其专业技能和经验水平应与他们的职责范围相符，如：管理技能、实验室安全、检验安排、预算、实验研究、实验结果的评估和数据偏差的调查、技术报告书写等。第2页，共97页，2023年，2月20日，星期四

二、实验室环境控制【原则】实验室布局设计的基本原则是既要最大可能防止微生物的污染，又要防止检验过程对环境和人员造成危害。通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉污染的风险降低到最低。一般情况下，医疗器械微生物检验的实验室应具有开展无菌检查、微生物限度检查等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、培养室、文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。第3页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、实验室环境控制【要求】1、无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。用于无菌检查和微生物限度检查的洁净操作室应配有属于“人流净化”的更衣室及属于“物流净化”的缓冲间或传递窗（柜），使进入洁净操作室的实验人员和实验物品分别经适当净化后进入实验操作间。无菌室分无菌操作室和缓冲间。无菌操作室应具有空气除菌过滤的单向流空气装置。操作室或工作台应保持正压。应在压差十分重要的相邻级别区之间安装压差表。第4页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、实验室环境控制【要求】2、微生物限度检查的全过程，均应遵守无菌操作，严防再污染。因此，微生物限度检查宜在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行；限度检查实验室应配有相应的人流和物流缓冲间，并定期作环境监测。第5页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、实验室环境控制

【要求】

3、菌种处理、微生物鉴别和阳性对照室菌种的处理包括的内容比较多，如菌种的传代、保藏、制备以及培养基促生长实验、阳性对照、微生物方法验证、消毒剂和防腐剂的效力测定和对环境中分离菌的鉴别等，这些实验过程中都在处理活的微生物，处理不当会造成实验室环境污染，影响其他实验结果，因此，该室必须与其他实验室严格分开；必要时，应按实验室性质的需要保持对相邻实验室的相对压差；需采取必要的消毒方式确保实验室洁净条件合格（如臭氧，乳酸熏蒸等），以净化层流台作为局部100级的控制措施，最好是使用生物安全柜，所有的与活毒菌种相关的活动都应在层流台或生物安全柜中进行。每次实验结束后要对层流台或生物安全柜及整个实验室环境进行消毒。所有与菌种相关的实验废物均应经过灭菌处理后方可丢弃。第6页，共97页，2023年，2月20日，星期四二、实验室环境控制【要求】4、培养室及其他功能间培养室用于放置培养细菌和真菌的培养箱。准备区即试液及培养基配制/灭菌区域、实验器皿洗涤、烘干、灭菌、实验用品及易耗品储藏等没有特殊要求的功能间，可为一般清洁环境。第7页，共97页，2023年，2月20日，星期四微生物环境控制相关标准GB/T16292:2010，医药工业洁净室(区)悬浮粒子测试方法GB/T16293:2010，医药工业洁净室(区)浮游菌测试方法GB/T16294:2010，医药工业洁净室(区)沉降菌测试方法GB50073-2001洁净厂房设计规范ISO14644-1:1999洁净室及相关受控环境第1部分：空气洁净度等级划分ISO14644-4:1999洁净室及相关受控环境第4部分：设计、施工、运行ISO14644-7:1999洁净室及相关受控环境第7部分：分离的设备第8页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌室环境控制设备微粒计数仪第9页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌室环境控制设备浮游菌采样仪第10页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌室环境控制设备第11页，共97页，2023年，2月20日，星期四洁净室沉降菌测试方法1.测试时间1.1对单向流，如100级净化房间及层流工作台，测试应在净化空调系统正常运行不少于10min后开始。1.2对非单向流，如10000级、100000级以上的净化房间，测试应在净化空调系统正常运行不少于30min后开始。2.采样方法将已制备好的培养皿按要求放置，打开培养皿盖，使培养基表面暴露0.5h，再将培养皿盖盖上后倒置。2.2.培养全部采样结束后，将培养皿倒置于恒温培养箱中培养。在30℃～35℃培养箱中培养，时间不少于48h。每批培养基应有对照试验，检验培养基本身是否污染。可每批选定3只培养皿作对照培养。第12页，共97页，2023年，2月20日，星期四洁净室沉降菌测试方法3.菌落计数用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用5～10倍放大镜检查，有否遗漏。若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辨时仍以2个或2个以上菌落计数。4.注意事项4.1测试用具要作灭菌处理，以确保测试的可靠性、正确性。4.2采取一切措施防止人为对样本的污染。4.3对培养基、培养条件及其他参数作详细的记录。4.4由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀物的区别，必要时用显微镜鉴别。4.5采样前应仔细检查每个培养皿的质量，如发现变质、破损或污染的应剔除。第13页，共97页，2023年，2月20日，星期四洁净室沉降菌测试方法5.测试规则5.1.测试状态5.1.1沉降菌测试前，被测试洁净室（区）的温湿度须达到规定的要求，静压差、换气次数、空气流速必须控制在规定值内。5.1.2沉降菌测试前，被测试洁净室（区）已经过消毒。5.1.3测试状态有静态和动态两种，测试状态的选择必须符合生产的要求，并在报告中注明测试状态。5.2.测试人员5.2.1测试人员必须穿戴符合环境洁净度级别的工作服。5.2.2静态测试时，室内测试人员不得多于二人。第14页，共97页，2023年，2月20日，星期四最少采样点数目面积洁净度级别10010000100000<102～322≥10～＜20422≥20～＜40822≥40～＜1001642≥100～＜20040103≥200～＜40080206≥400～＜10001604013≥1000～＜200040010032200080020063注：表中的面积，对于单向流洁净室.指的是送风面积；对非单向流洁净室，指的是房间面积第15页，共97页，2023年，2月20日，星期四同时满足最少平皿数洁净度级别所需Φ90mm培养皿数（以沉降0.5h计）100级1410000级2100OOO级2第16页，共97页，2023年，2月20日，星期四采样点的布置采样点的位置可以同悬浮粒子测试点。a）工作区采样点的位置离地0.8m～1.5m左右（略高于工作面）。b）可在关键设备或关键工作活动范围处增加采样点。采样点位置的详细规则见附录B（标准的附录）。第17页，共97页，2023年，2月20日，星期四采样点布置第18页，共97页，2023年，2月20日，星期四洁净度级别沉降菌浮游菌尘粒的最大允许数/m3个/（Φ90mm）0.5h）活微生物数/m3≥0.5µm≥5µm100≤1≤5≤3500－10000≤3≤100≤350000≤2000环境检测参照标准第19页，共97页，2023年，2月20日，星期四微生物实验室管理严格区分污染区及清洁区第20页，共97页，2023年，2月20日，星期四相关标准GB15979-2002一次性使用卫生用品卫生标准GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法和标准第21页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、灭菌控制

微生物实验使用的试剂、器材等常需用湿热灭菌法。湿热灭菌的温度和时间需验证，必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL≤10-6。灭菌程序经验证合格后方可使用。定期进行BD实验、真空泄漏测试、温度参数测试（空载热分布、定载热穿透、满载热穿透）、压力改变速率测试（GB8599-2008大型蒸汽灭菌器技术要求），同时以生物指示剂验证灭菌效果,必须保证物品灭菌后无菌保证值SAL小于百万分之一。第22页，共97页，2023年，2月20日，星期四三、灭菌控制

所有器具应采用可靠方法灭菌置压力蒸汽灭菌器内121℃30min

或置电热干燥箱内180℃2h。第23页，共97页，2023年，2月20日，星期四湿热灭菌控制相关标准GB18281.3-2000医疗保健产品灭菌生物指示物第3部分:湿热灭菌用生物指示物ISO11138-3-2006医疗保健产品灭菌.生物指示物.第3部分:湿热灭菌用生物指示剂第24页，共97页，2023年，2月20日，星期四四、培养基管理1、培养基的制备2、培养基的贮藏3、培养基的质量控制实验第25页，共97页，2023年，2月20日，星期四四、培养基管理灵敏度检查（中国药典2010）无菌检查（ISO11737.2:2009或GBT19973.2-2005）第26页，共97页，2023年，2月20日，星期四五、无菌操作定义：是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法。无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。无菌操作技术主要包括两方面：创造无菌的培养环境及在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入。创造无菌的培养环境包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；防止一切其它微生物的侵入的措施包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。第27页，共97页，2023年，2月20日，星期四微生物实验前准备微生物实验控制1：人员管理微生物实验控制2：环境控制微生物实验控制3：灭菌控制微生物实验控制4：培养基管理微生物实验控制5：无菌操作第28页，共97页，2023年，2月20日，星期四微生物基本操作

琼脂平板接种法琼脂斜面接种法半固体接种法肉汤培养基接种法第29页，共97页，2023年，2月20日，星期四琼脂平板接种法细菌在自然界及人体中分布广，种类多，为了了解菌谱，须先将各种细菌分离，获得纯菌培养物后才能进一步作细菌的鉴定。琼脂平板培养基因面积大，接种后可达到分离的目的，常称分离培养法。平板接种方法有多种。以下介绍平行划线法及分区划线法。第30页，共97页，2023年，2月20日，星期四琼脂平板接种法（分离培养法）分区划线法第31页，共97页，2023年，2月20日，星期四琼脂平板接种法（分离培养法）平行划线法第32页，共97页，2023年，2月20日，星期四琼脂平板接种法（分离培养法）第33页，共97页，2023年，2月20日，星期四单个菌落第34页，共97页，2023年，2月20日，星期四单个菌落第35页，共97页，2023年，2月20日，星期四琼脂斜面接种法目的：多用于纯种细菌的增菌和保存菌种方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许。拔去琼脂斜面培养基塞，管口经火焰上灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上在琼脂上蜿蜒划线；接种后，管口在火焰上灭菌，塞回塞，接种环灭菌：在试管口处做好标记，置37℃培养18－24小时第36页，共97页，2023年，2月20日，星期四大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面第37页，共97页，2023年，2月20日，星期四肉汤接种法目的：用于增菌。方法：用灭菌接种环取细菌培养物少许；以无菌操作将沾有细菌的接种环伸入肉汤中，将环上细菌轻轻研磨于接近液面的管壁上，然后将试管稍倾斜，使肉汤碰及细菌即可；接种后管口灭菌，塞回塞，接种环灭菌，并做好标记，置37℃培养18-24小时第38页，共97页，2023年，2月20日，星期四半固体接种法（穿刺接种法）目的：增菌和保存菌种；观察细菌有无动力。方法：用接种针，将取有细菌的接种针自培养基中央刺入（不要接触管底），沿原穿刺线拨出，注意在刺入与拔出时不可晃动接种针；接种后做好标记。置37℃培养18-24小时．第39页，共97页，2023年，2月20日，星期四半固体琼脂培养基（0.5%）

第40页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备（使用麦氏比浊管）麦氏比浊管：是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。第41页，共97页，2023年，2月20日，星期四麦氏比浊管的配比管号(McFarland)0.5123450.25%BaCl2（ml）0.20.40.81.21.62.01%H2SO4(ml)9.89.69.28.88.48.0细菌的近似浓度(×108/ml)13691215第42页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【材料】1、实验所需的微生物新鲜培养物如：金黄色葡萄球菌新鲜培养物；2、无菌生理盐水、麦氏比浊管；3、酒精灯、接种环、无菌吸管、平皿。第43页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【方法】1、轻摇标准试管；2、无菌操作挑取金黄色葡萄球菌新鲜培养物至无菌生理盐水试管（与标准管相同直径）中混匀，直到浊度与所要求的标准管的浓度相同；3、序列稀释已挑取菌落的生理盐水试管至所需的菌液浓度如：100cfu/ml;4、用平皿计数法验证所配置菌液的实际浓度。第44页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备（使用麦氏比浊管）【使用技巧】1、直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。2、找张白纸打上平行直线，利用光在不同浓度液体折射不同帮助观察比较。第45页，共97页，2023年，2月20日，星期四123456786×1086×1076×1066×1056×1046×1036×1026×101麦氏1号管稀释梯度表（cfu/ml）第46页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备（使用分光光度仪）分光光度仪

第47页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌悬液制备的保存菌悬液制备：菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜孢子悬液使用。第48页，共97页，2023年，2月20日，星期四培养基质量控制：灵敏度检查

灵敏度检查所需的六种菌：金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]ATCC6538铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]ATCC9027枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]ATCC6633生孢梭菌[CMCC(B)64941]ATCC11437白色念珠菌[CMCC(F)98001]ATCC10231黑曲霉[CMCC(F)98003]ATCC16404根据培养基的功能选择灵敏度实验所需菌种第49页，共97页，2023年，2月20日，星期四中国药典2005年版明确规定：培养基灵敏度、微生物限度检查法检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。培养基质量控制：灵敏度检查第50页，共97页，2023年，2月20日，星期四中国药典2010年版在新增的“药品微生物实验室规范指导原则”中对菌种有了较为明确的规定：允许使用标准菌株和商业派生菌株标准菌株应按保藏机构提供的说明进行复活标准储备菌株应进行纯度和特性确认标准储备菌株建议采用低温冷冻干燥、液氮贮存或超低温冷冻保藏的方法标准储备菌株可用于制备每月或每周一次转种的工作菌株冷冻菌株解冻后不得重新冷冻和再次使用工作菌株不可替代标准菌株，商业派生菌株仅可用作工作菌株培养基质量控制：灵敏度检查第51页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌株传代基本概念标准菌株：由国内或国际菌种保藏机构保藏的，遗传学特性得到确认和保证并可追溯的菌株。（0代）标准储备菌株：由标准菌株经一次传代得到的培养物。（1代）商业派生菌株：由供应商提供的所有特性与标准菌株等效的菌株。（2代）工作菌株：由标准储备菌株经传代得到的培养物。（2代）代：将活的微生物接种到新鲜培养基中进行培养，并希望获取新的微生物培养物。这种操作方式，新培养物对接种培养物而言就称为一代。第52页，共97页，2023年，2月20日，星期四制备工作菌种进行菌种保藏的模式图采购的第2代超低温冷冻标准储备菌种工作菌种第3代工作菌种第3代工作菌种第4代工作菌种第4代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代工作菌液第5代第53页，共97页，2023年，2月20日，星期四各类菌种保藏条件及时间

菌种培养基保存温度传种时间细菌一般多用于营养琼脂或根据菌种规定选用培养基4~6℃芽孢杆菌3~6个月，其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6℃一般4~6个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等4~6℃每4个月移植一次（每2个月移植一次）第54页，共97页，2023年，2月20日，星期四

菌种保管

•菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。

•菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。

•各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。

•购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。

第55页，共97页，2023年，2月20日，星期四FTM的灵敏度检查培养基标准菌种(10-100cfu/ml)30～35℃培养培养天数12345FTM(12ml)金黄色葡萄球菌管1管2緑脓杆菌管3管4枯草芽孢杆菌管5管6生胞梭菌管7管8空白对照管9第56页，共97页，2023年，2月20日，星期四培养基质量控制：灵敏度检查接种金黄色葡萄球菌、緑脓杆菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30～35℃培养18～24h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种生胞梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐液体培养基中，30～35℃培养18～24h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂培养基中，23～28℃培养24～48h；用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml菌液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7d,加3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成10-100cfu/ml孢子悬液备用。第57页，共97页，2023年，2月20日，星期四菌种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉；制备成活菌数＜100cfu的菌悬液备用菌株传代次数不得超过5代培养基接种每种菌接种至2管相应的培养基，另取一支不接种作空白对照，按规定温度时间培养。结果判断空白对照管应无菌生长，每种菌接种后的2管培养基管均生长良好，该培养基的灵敏度检查符合规定。培养条件金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌接种至营养肉汤（或营养琼脂培养基）30～35℃培养18～24小时；生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养基中30～35℃培养3天；白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基中23～28℃培养5天培养基质量控制：灵敏度检查第58页，共97页，2023年，2月20日，星期四培养基质量控制：无菌检查

每批灭菌的培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14天，应无菌生长。第59页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验第60页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验预防假阳性措施1在一个专门准备、环境控制的房间内的层流罩的环境中进行测试2在整个测试过程中使用无菌技术3用避免污染的方法把测试器皿、培养基和测试物品引入测试区4测试产品表面的细菌污染，在引导测试物品进入测试区之前，先对产品的外包装进行消毒。5对测试中使用的设备、材料和产品进行灭菌6简化进行测试必须的操作7尽量避免悬浮微粒的产生8环境时时监测（沉降菌检测）第61页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验相关标准GBT19973.2-2005-医用器材的灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程的无菌试验ISO11737-22009-医用器材的灭菌微生物学方法第二部分：确认灭菌过程的无菌试验第62页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验：培养条件不论哪种无菌试验方法：FTM32.5±2.5℃，不少于14天；SCDB22.5±2.5℃，不少于14天；改良马丁23-28℃，不少于14天。如果14以内观察到阳性结果，不必继续培养。第63页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验阳性对照应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品．以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌；抗霉菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。加菌量小于l00cfu，供试品用量同供试品无菌实验时每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养48～72小时应生长良好．第64页，共97页，2023年，2月20日，星期四阴性对照阴性对照：阴性对照供试品无菌实验时，应取相应溶剂和稀释同法操作作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。第65页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验：结果判断肉汤培养基有菌生长的常见三种形式：混浊生长：液体变混浊。菌膜：液体澄清，表面有一薄层菌膜。沉淀生长：液体澄清，管底有沉淀物第66页，共97页，2023年，2月20日，星期四混浊生长：液体变混浊第67页，共97页，2023年，2月20日，星期四肉汤培养基有菌生长的常见形式第68页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验：结果判断1.阳性对照管应生长良好，阴性对照管应无菌生长2.培养期间逐日观察并记录是否有菌生长，如培养14天后，培养基出现浑浊，但不能确定是否有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基或划线接种于斜面培养基上，细菌培养两天，霉菌培养三天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。第69页，共97页，2023年，2月20日，星期四释出物检查

第70页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验验证：释出物检查目的：对未知或可疑的供试品，在进行无菌试验实验前进行方法验证试验，以确认供试品在该试验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。第71页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌实验验证：释出物检查取灭菌产品以无菌操作转移到培养基中,30-35℃培养24hrs；

注意：使用与实际无菌实验同种等量的培养基接种每毫升浓度小于100cfu的菌种稀释液在无菌培养基内，一式两份，其中一份加入无菌试样，另一份作为阳性对照，并在合适的温度培养不超过5天。按表1所列菌种重复以上步骤。第72页，共97页，2023年，2月20日，星期四无菌样品100cfu菌种＋无菌样品实验组对照组释出物检查在合适的温度培养不超过5天。选择合适的微生物，重复以上步骤。第73页，共97页，2023年，2月20日，星期四释出物检查解释：通过与阳性对照对比，如果在培养容器内看不到微生物生长，则说明使用的样品能抑止细菌或霉菌的生长。可以考虑使用无菌中和剂，如吐温80、卵磷脂、偶氮植物凝血素、β-内酰胺酶。如果中和剂无效，增加培养基的量。尽量使用能使试验微生物生长的最小的培养基的量。第74页，共97页，2023年，2月20日，星期四大豆酪蛋白消化物培养基(SCDM)菌种培养温度培养条件培养时间枯草芽孢杆菌ATCC663322.5±2.5º需氧3天白色念珠菌ATCC1023122.5±2.5º需氧3-5天释出物检查常用菌种第75页，共97页，2023年，2月20日，星期四初始污染菌第76页，共97页，2023年，2月20日，星期四定义

生物负载：一件产品和/或包装上存活的微生物总数。生物负载估计值：通过对活菌计数或灭菌前活菌计数加上一个回收效率补偿系数，得出的组成生物负载的微生物数值。第77页，共97页，2023年，2月20日，星期四初始污染菌相关标准GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌微生物学方法第一部分产品上微生物总数的估计ISO-11737-1:2006GBT19973.1-2005-医用器材的灭菌微生物学方法第一部分产品上微生物总数的估计第78页，共97页，2023年，2月20日，星期四样品份额取样原则

1定义：样品份额(SIP)sampleitemportion，即从某一保健产品单元上取出的用于试验的部分。2取样注意事项2.1若可操作，试验应使用整个产品单元。但这往往被认为是不可行的，产品单元上的样品份额宜在实验室易于操作的前提下尽可能大。2.2如果所用的样品份额((SIP)小于一个完整的产品单元，则应选择代表产品单元的具有微生物的部分。如果已验证微生物在产品单元上是均匀分布的，应从产品单元上任一部位选择样品份额。在缺少这些验证的情况下，应从产品单元上随机选择几个部分作为样品份额。2.3样品份额本身应对产品单元内的产品有代表性。当产品分成不同的部分，可以分装于两个或多个容器内。样品份额可以根据供试产品单元的长度、质量、体积或表面积。如果产品单元有标签说明只是液路无菌，宜把液路视为整个试验单位。(即SIP=1)2.4SIP选择举例，见表1第79页，共97页，2023年，2月20日，星期四表1SIP选择举例选择SIP的依据标准样品表面积放植物(非吸收)质量粉状、手术衣/单、植入物(可吸收)长度管路(直径不变)管路(直径不变)体积水、液体液路静脉输注器，液袋第80页，共97页，2023年，2月20日，星期四表1SIP选择举例选择SIP的依据标准样品表面积放植物(非吸收)质量粉状、手术衣/单、植入物(可吸收)长度管路(直径不变)管路(直径不变)体积水、液体液路静脉输注器，液袋第81页，共97页，2023年，2月20日，星期四校正因子第82页，共97页，2023年，2月20日，星期四校正因子定义：用于对活菌计数或灭菌前活菌计数进行修正的数值，以补偿产品上无法完全洗脱的微生物，以便计算出生物负载估计值。第83页，共97页，2023年，2月20日，星期四校正因子反复洗脱方法实验步骤1取样品1件或sip，投入一定量的无菌洗脱液中(A)。2样品的处理采用旋涡混台器(2800次／min)，振荡2min。3注皿：取处理洗脱液A2ml，分别注入两个无菌平皿中，每平皿1ml。4再洗脱:将样品从洗脱液A中取出沥干，移入另一定量的无菌洗脱液中(B)。5再处理:将B洗脱液置旋涡混台器(2800次／min)振荡2min。6再注皿:取B洗脱液2ml，分别注入两个无菌平皿内，每平皿lml。注：当微生物数少时,从B洗脱液开始，即可用无菌滤膜过滤后直接放培养基中培养。7如此反复洗脱4次．即A、B、C和D，直至洗脱累积量(初始污染菌)不再增加，最后沥干样品，将其平铺于无菌平皿中(E)。然后将熔化并冷至45～48℃的NA培养基，分别注入A～E各平皿每皿15ml。8待凝固后，放置在规定的培养条件下(30～35℃，48h～82h)培养，进行活菌计数。第84页，共97页，2023年，2月20日，星期四校正因子=1/0.3825=2.61

编号平皿均数×稀释倍数琼脂覆盖总数回收率％洗脱1洗脱2洗脱3洗脱4平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均平皿1平皿2平均180010003001008220836.23260080020005160537.3837006002002002170241.13平均38.25校正因子计算第85页，共97页，2023年，2月20日，星期四校正因子计算同批产品，需抽取3-5件，进行重复性试验，确定最小、最大及平均回收率和初始污染菌数。根据校正因子，灭菌前初始污染计数乘以校正因子即为产品带菌总数。第86页，共97页