发酵液的预处理与固液分离

发酵液的预处理与固液分离第1页，共44页，2023年，2月20日，星期三第二章发酵液的预处理与固液分离目的分离菌体和其他悬浮颗粒(细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物)；除去部分可溶性杂质和改变滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。意义

从微生物发酵液或细胞培养液中提取生化物质的第一个必要步骤就是预处理和固液分离，他关系着下道工序的工艺设计。

第2页，共44页，2023年，2月20日，星期三第一节发酵液的预处理和固液分离

掌握悬浮液的一般特征和预处理的方法，了解悬浮液的分离过程和分类及常用的过滤法。

（一）、悬浮液的基本特征

（二）、悬浮液的预处理

（三）、悬浮液分离过程和分类

（四）、过滤法

第3页，共44页，2023年，2月20日，星期三一、发酵液的基本特征细菌及某些放线菌菌体细小，发酵液粘度大，不能直接过滤。由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在会造成滤液浑浊，滤速极慢。发酵液中杂质很多，其中对提炼影响最大的是高价无机离子（Ca2+、Mg2+、Fe3+

）和杂蛋白质等。第4页，共44页，2023年，2月20日，星期三二、发酵液的预处理采用理化方法设法增大悬浮液中固体粒子的大小、或降低粘度，以利于过滤。去除会影响后续提取的高价无机离子和杂蛋白质等。第5页，共44页，2023年，2月20日，星期三

预处理的方法1，高价无机离子的去除方法2，杂蛋白质的去除3，发酵液的凝聚和絮凝第6页，共44页，2023年，2月20日，星期三1高价无机离子的去除方法钙离子，可用草酸，反应生成的草酸钙能促使蛋白质凝固，提高滤液（也称为原液）质量.镁离子，可用三聚磷酸钠它和镁离子形成可溶性络合物，用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的浓度。

Na5P3O10+Mg2+=MgNa3P3O10+2Na黄血盐与铁离子形成普鲁土盐沉淀

3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4[Fe(CN)6]3+12K+第7页，共44页，2023年，2月20日，星期三2杂蛋白质的去除方法热变性沉淀大幅度改变pH加有机溶剂第8页，共44页，2023年，2月20日，星期三

杂蛋白质的去除方法热变性变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质。第9页，共44页，2023年，2月20日，星期三

杂蛋白质的去除方法沉淀蛋白质在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。由于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性质通常强于碱性，因而很多蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0－5.5）。在酸性溶液中,蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀。在碱性溶液中，能与一些阳离子，如Ag，Ca2+、Mg2+、Fe3+和Pb等形成沉淀。第10页，共44页，2023年，2月20日，星期三

杂蛋白质的去除方法大幅度改变pH在抗生素生产中，常将发酵液pH调至偏酸性范围（pH2－3）或较碱性范围（pH8一9）使蛋白质凝固第11页，共44页，2023年，2月20日，星期三

杂蛋白质的去除方法加有机溶剂加有机溶剂使蛋白质变性的方法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。此外，还可以利用吸附作用除去蛋白质。例如，四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾[K2Zn3Fe（CN）5]

2的胶状沉淀来吸附蛋白质。第12页，共44页，2023年，2月20日，星期三3发酵液的凝聚和絮凝凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。絮凝技术预处理发酵液的优点不仅在于过滤速度的提高，还在于能有效地去除杂蛋白质和固体杂质，如菌体、细胞和细胞碎片等，提高了滤液质量第13页，共44页，2023年，2月20日，星期三3发酵液的凝聚和絮凝凝聚是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。第14页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液的凝聚原理通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电引力的作用使溶液中带相反电荷的粒子（即正离子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分，第15页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液的凝聚原理在相距胶核表面约一个离子半径的平面以内，正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或紧密层

在平面以外，剩余的正离子则在溶液中扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩散双电层的结构模型，如图所示。第16页，共44页，2023年，2月20日，星期三第17页，共44页，2023年，2月20日，星期三当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液体，随着它一起滑移，这一薄层，厚度比吸附层稍大，滑移（剪切面）在图中用波纹线表示。

第18页，共44页，2023年，2月20日，星期三这三种电位中只有ζ电位能实际测得，所以可以认为它是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双电层的特征，并作为研究凝聚机理的重要参数。胶粒能保持分散状态的原因主要是带有相同电荷和扩散双电层的结构，一旦由于布朗（Brown）运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开的排斥力，从而阻止了粒子的聚集。ζ电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分散程度也越大，第19页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液的凝聚原理此外，由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。但是，水化膜主要是伴随胶粒带电而引起的，一旦ζ电位降低或消除，水化层也会随之减弱或消失。第20页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液的凝聚原理根据静电学基本定理，可导出ζ电位的基本公式为：ζ＝4πqδ/D其中D—水的介电常数；q—胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密度；δ—扩散层的有效厚度可知，ζ电位与扩散层厚度δ和电荷密度q成正比，而扩散层厚度又与溶液中离子强度有关，当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间的范德华引力时，由于热运动的结果导致胶粒的互相碰撞而聚集起来。第21页，共44页，2023年，2月20日，星期三

方法由此可见，在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，能降低ζ电位和脱除胶粒表面的水化膜，就能导致胶粒间的凝聚作用。常用的凝聚剂电解质有Al2（SO4）3·18H2O（明矾）；AlC13·6H2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。第22页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液的絮凝原理絮凝作用有机高分子聚合物絮凝剂，它们具有长链线状的结构，是一种水溶性的聚合物，分子量可高达数万至一千万以上，在长的链节上含有相当多的活性功能团，可以带有多价电荷（如阴离子或阳离子），也可以不带电性（如非离子型）。它们通过静电引力、范德华分子引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面，一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同颗粒的表面上，产生了架桥联接，生成粗大的絮团，这就是絮凝作用。第23页，共44页，2023年，2月20日，星期三

方法目前最常见的高分子聚合物絮凝剂是有机合成的聚丙烯酰胺类衍生物。根据活性基团在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型（含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。

聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以及种类多等优点，所以适用范围广。第24页，共44页，2023年，2月20日，星期三它们的主要缺点是存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，要考虑这些物质最终能否从产品中去除。近年来还发展了聚丙烯酸类阴离子絮凝剂，它们无毒，可用于食品和医药工业中。还有聚苯乙烯类衍生物及无机高分子聚合物絮凝剂，如聚合铝盐和聚合铝铁盐等。除此以外，也可采用天然有机高分子絮凝剂。如多聚糖类胶粘物，海藻酸钠，明胶、骨胶、壳多糖和脱乙酰壳多糖等。第25页，共44页，2023年，2月20日，星期三

方法对于带负电性菌体或蛋白质来说，阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低粒子排斥电位和产生吸附架桥的双重机理，所以可以单独使用。第26页，共44页，2023年，2月20日，星期三

方法对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，则主要通过分子间引力和氢键作用产生吸附架桥，它们常与无机电解质凝聚剂搭配使用。首先加入无机电解质，使悬浮粒子间的相互排斥能降低，脱稳而凝聚成微粒，然后，再加入絮凝剂。无机电解质的凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好的条件，从而，提高了絮凝效果。这种包括凝聚和絮凝机理的过程，常称为混凝。第27页，共44页，2023年，2月20日，星期三第28页，共44页，2023年，2月20日，星期三

影响絮凝的因素絮凝剂的添加量发酵液的pH絮凝剂的分子量搅拌转速搅拌时间第29页，共44页，2023年，2月20日，星期三絮凝剂加量对絮凝效果(滤速)的影响

料液中，絮凝剂浓度增加有助于架桥充分，但是过多的加量反而会引起吸附饱和，在每个胶粒上形成覆盖层而使胶粒产生再次稳定现象第30页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵液pH对阴离子聚丙烯酰胺絮凝效果的影响

溶液pH的变化常会影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响分子链的伸展形态。电离度增大，由于链节上相邻离子基团间的电排斥作用，而使分子链从卷曲状态变为伸展状态，所以架桥能力提高。第31页，共44页，2023年，2月20日，星期三

二、发酵液的过滤微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。第32页，共44页，2023年，2月20日，星期三1、影响过滤速度的因素过滤速度和以下因素有关菌种。发酵条件。培养基的组成未用完的培养基消沫油发酵周期第33页，共44页，2023年，2月20日，星期三

菌种对过滤速度影响真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达10μm，发酵液容易过滤，不需特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤机过滤。放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅0.5~1.0μm左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。第34页，共44页，2023年，2月20日，星期三培养基的组成对过滤速度影响用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难；发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。第35页，共44页，2023年，2月20日，星期三发酵周期对过滤的影响

正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞自治后的分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。第36页，共44页，2023年，2月20日，星期三2、改善过滤性能的方法等电点蛋白质变性吸附凝聚和絮凝加入助滤剂直接在发酵液中形成填充-凝固剂酶解作用第37页，共44页，2023年，2月20日，星期三

过滤助剂助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。过滤助剂可解决两个问题滤饼的可压缩性问题小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题常用的过滤助剂硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉第38页，共44页，2023年，2月20日，星期三助滤剂的加入有两种方法：在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)，该方法，会使滤速降低，但滤液透明度直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。）第39页，共44页，2023年，2月20日，星期三

填充-凝固剂改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4等)。生成