临床色谱质谱检验技术 第三章 生物样品制备（三）-李维-2017.03.24

第三章生物样品制备临床基因组教研室李维邮箱：lab-liwei@2017.03.24《临床色谱质谱检验技术》二、复习三、生物样品制备要求主要内容《临床色谱质谱检验技术》六、小结与思考四、生物样品的类型一、教学要求五、常用样品制备技术

一、教学要求《临床色谱质谱检验技术》了解：生物样品制备的必要性和原则熟悉：生物样品的类型及生物样品制备技术的临床应用及前景掌握：常用生物样品制备技术的基本原理、操作流程及特点为今后从事临床色谱质谱实验室检验工作打下基础。第三章教学要求4/3/2023教学形式及学时教学形式：理论教学学时：2第三章教学要求4/3/2023二、复习《临床色谱质谱检验技术》气相色谱柱的构造复习1毛细管气相色谱柱的参数复习2柱参数固定液名称柱长柱内径固定液膜厚柱温限复习3液相色谱柱的构造柱管（含有填料，柱内壁多经抛光，可

提高柱效，减少管壁效应）柱头

锥套：用于密封筛板：用于封堵住填料并使其不被流动相

冲出柱外而流失螺帽不同厂家和型号的柱子构造会有一定的差别色谱柱各组件均为不锈钢材质，能耐受一般的溶剂，含氯化合物有腐蚀作用，需谨慎使用，以免被腐蚀柱参数物理参数柱长、内径、颗粒形状、粒径、孔径、比表面积化学参数

填料基质、键合相、碳载量、封端复习4液相色谱柱的柱参数取决于分析的目的取决于样品的化学性质三、生物样品制备要求《临床色谱质谱检验技术》临床实验室生物样品分析流程样品采集医生选择检测项目病人采样前准备采样前注意事项样品保存运输……样品制备稀释浓缩加温染色离心蛋白沉淀液液萃取固相萃取衍生化……分析检测显微镜法放射免疫分析（RIA）酶联免疫分析（EIA）化学发光免疫分析（CLIA）电泳法HPLC法GC-MS法LC-MS法ICP-MS法……数据处理MasshunterEZchromChemStation检查峰形检查曲线绘制标准曲线计算结果……结果报告数据上传至病人信息系统核对病人信息结果建议解释出具检测报告……临床实验室传统生化检测工作流程样品传输系统

开盖子

离心储存管理器自动离心

盖盖子样品分拣自动分装在线分析接口罗氏分析接口技术人员进行样本接收技术人员在LIS系统中领取标本，核对并按顺序生成工作清单技术人员清点标本、对样本进行编号，移取标本到处理管中技术人员对标本按顺序进行处理技术人员手动录入工作清单，并将编辑生成仪器运行列表仪器按照列表对样本进行检测技术人员对结果进行审核，生成结果列表；并对数据情况进行登记技术人员将结果列表导入LIS系统，生成结果报告；审核批准临床色谱质谱实验室检测工作流程临床色谱质谱实验室检测工作流程-时间占比临床色谱质谱实验室检测工作流程—出错来源样品处理30%操作者19%色谱柱11%污染4%标准曲线9%仪器8%样品引入6%积分6%色谱图7%样品制备=样品处理+操作者+污染

大约占到50%样品制备时间长，易出错，why？样品采集分析检测原形样品不适合直接进行在线分析！种类繁多——血液、尿液、唾液、乳汁、组织等；成分复杂——数百乃至上千种化合物，大分子（蛋白质、核酸），小分子（脂肪、糖、尿酸）；浓度太低——待测物含量低，不进行富集浓缩，仪器灵敏度无法满足直接检测要求；样品太“脏”——基质组分的存在影响样品测定，产生基质效应；太“危险”——污染物可能成为“色谱柱杀手”、离子源污染。

太“脏”？“太“危险”？样品制备目的净化样品富集组分去除干扰成分减少基质效应提高灵敏度保护进样系统和色谱柱简化分析过程提高检测通量明确生物样品制备的目的和要求样品制备原则注意分析物的浓度及存在形式掌握生物样品基质的性质及特点防止和避免欲测定组分发生化学变化或损失考虑样品的量或体积是否有特殊的化学修饰或衍生化防止和避免欲测定组分被污染制备方法简单易行四、生物样品类型临床检验生物样品的类型生物样品血液尿液粪便脑脊液浆膜腔积液关节腔积液精液前列腺液阴道分泌物胃液+十二指肠引流液羊水痰液唾液组织生物样品血液尿液唾液组织临床色谱质谱实验室常用生物样品类型血液样品全血混合5~10次混合5~10次2000-3000rpm5-10min放置30~60min2000-3000rpm5-10min尿液样品保存条件保存时间？冷藏？是否防腐？体积易获得样品量大容器清洁一次性有盖容器方便运输，便于保存采集时间晨尿？随机尿？24H尿？唾液样品无剌激安静状态下进行；采集前应漱口，除去口腔中的食物残渣；唾液自然分泌；采集后离心，分取上清液作为分析样品。组织样品获取组织精确并及时迅速放置在冰块或液氮冷冻清洗冷生理盐水漂洗擦干称重均质研磨机械搅拌漩涡振荡声波降解珠磨酶解提取和分析肿瘤、病变组织等干血滤纸片（driedbloodspot，DBS）方法：将全血采集在滤纸片上，干燥后得到干血斑块，经溶剂萃取后，通过荧光反应法、串联质谱法等分析干血斑中待检测组分的信息来反映患者的诊断结果特殊生物样品类型应用范围：新生儿筛查、代谢产物含量、酶活性代谢相关疾病的筛查、药物动力学研究、基因检测及病毒DNA含量等

随着串联质谱技术等的发展，干血滤纸片在遗传代谢类疾病的诊断及筛查中的应用价值日渐突显干血滤纸片优势采集方便相比于全血，稳定性较高储存运输方便，降低成本所需血量少在需要多次采样来进行诊断的检测中有着特定的优势局限性对于部分遗传代谢病，干血滤纸片仅能作为高危筛查或者新生儿大规模筛查的手段确诊仍需要进一步对全血进行酶活性检测，并结合基因突变检测完成疾病的诊断干血滤纸片尿滤纸片特殊生物样品类型保存、运输方便，稳定性较好，降低成本五、常用样品制备技术

稀释浓缩加温染色蛋白沉淀液液萃取固相萃取衍生化超滤免疫亲和萃取水解离心临床实验室样品制备技术液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品制备技术蛋白沉淀临床色谱质谱实验室常用样品制备技术

衍生化为什么要蛋白沉淀？蛋白质的存在会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而严重干扰分析测定；若直接进样，蛋白质会沉积在色谱柱上，造成色谱柱的污染、堵塞，严重缩短色谱柱的寿命。（一）蛋白沉淀法（proteinprecipitation,PPT）定义通过加入某种试剂，改变溶液环境，使蛋白质的构象发生变化，导致溶解度降低，生成不溶性颗粒。NO!!!基本步骤（一）蛋白沉淀法取样加入蛋白沉淀剂高速混合离心直接进样或稀释、或浓缩富集后进样盐析法饱和硫酸铵硫酸钠氯化钠氯化铵……有机溶剂沉淀法乙醇乙腈甲醇丙酮丙醇…….加入变性试剂三氯醋酸高氯酸焦磷酸锌盐铜盐汞盐……（一）蛋白沉淀法方法特点（一）蛋白沉淀法优点简单快速经济回收率高缺点样品被稀释，灵敏度受影响净化程度低，基质效应强色谱柱寿命短，离子源易污染为提升灵敏度，需溶剂蒸发液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品制备技术蛋白沉淀小结3-临床色谱质谱实验室常用样品制备技术

衍生化定义采用与水不相溶或微溶的有机溶剂，利用待测组分在两相溶剂中的溶解度或分配比的不同，将目标分析物从水相提取至有机相而实现分离、提取的方法。（二）液液萃取（liquid-liquidextraction,LLE）不互溶有机层水层基本步骤（二）液液萃取取样加萃取剂涡旋混匀取有机层吹干复溶分析检测（二）液液萃取影响萃取效率的因素（二）液液萃取溶液的pH非离子型的化合物提取效率高于离子型酸性分析物在酸性环境中萃取碱性分析物在碱性环境中进行萃取剂极性大小与水互溶性溶解性沸点高低不易乳化萃取操作萃取时间萃取容器萃取次数乳化现象方法特点（二）液液萃取优点灵活度高，可选择溶剂类型或改变pH及离子强度等；干扰少，可去除大量内源性物质；选择性相对较高，磷脂的残留量比较低；可蒸发萃取液，富集分析物；常温下操作、简单快速、经济实用。缺点耗时费力，一般为手工操作，难以实现自动化；对于极性大的分析物提取回收率低，所需样品量大；使用大量有机溶剂，污染环境。测定血清维生素A的样品制备目标分析物：血清视黄醇存在形式：与蛋白结合的复合物理化性质：脂溶性维生素举例取样稀释加水PPT加乙醇LLE加正己烷氮吹取上清液复溶流动相HPLC分析检测VitaminA1:C20H30O（286.45g·mol-1）VA六、小结与思考小结1-样品制备目的净化样品富集组分去除干扰成分减少基质效应提高灵敏度保护进样系统和色谱柱简化分析过程提高检测通量生物样品血液尿液唾液组织小结