大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

与蛋白酶K得溶液中消化分解蛋白质,再用酚与氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到得DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性就是能在SDS与EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在得情况下氨基酸,使DNA分子完整地分离出来、用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RN形成复合物,在高盐溶液中(0。7mol／LNaCl)就是可溶得,当降低溶液盐浓度molLNaCl过离心就可将CTAB-核蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB1)实验材料:大肠杆菌1)LB液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨10g/L,细菌培养用酵母提取物5(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7、0.用去离子水定容100ml,用20/2)TE缓冲液:1Mtris-HClpH8、0溶液(取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0(需浓盐酸约8。5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)TE缓冲液(10mMTris-HCl1MmEDTApH=8。0,1MTris—HClB0、5MEDTAPH=8。01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶K:(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,－20℃备用)4)CTAB/NaCl溶液:(5％w/v,5gCTAB溶于100ml0、5MNaCl溶液中,需加行二级培养,培养至对数期(4—6h)。2、取菌液1。5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液4、加入1ul蛋白酶K(20mg／ml),混匀,37℃保温1小时、5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。6、加30ulCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp离心10minDNA,5000rmp离心10min10、加500ul70％乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒:1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-0250次420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRaDV810A50650元3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411－01BacterialgDNAkit50次423元GD2411—02BacterialgDNAkit250次1798元4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒BSC12M1100次750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒DEZNA。TMBacterialDNAkit2003350元定量实验就是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR)得每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列(靶)数量、其中靶可以就是DNA、cDNA或RNA。【实验原理】在实时定量实验中,反应就是在PCR产物得扩增达到固定荧光水平时得循环期间时间点来描述得,而不就是在固定循环次数后累积得PCR产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行得循环次数中检测到得荧光。ﻫ在PCR得最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。该预定义得PCR循环范围称度(与基线循环相对应得Rn值)得数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度(deltaRn[∆Rn]值)与阈值交叉得点。∆Rn值与阈值交叉得分数循环定义为CT。1、定义实验属性后选择要设计得实验类型。1)ExperimentName(实验名称)、2)Barcode(条码),然后输入您得PCR反应板上得条码。(可不填)3)UserName(用户名)。选择Quantitation(定量)实验类型2、定义方法与材料在Methods＆Materials(方法与材料)屏幕上,选择用于实验得将StandardCurve(标准曲线)选为定量方法。标准曲线实验确定样板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2)为试剂选择TaqMan®Reagents(TaqMan试剂)(包括两个引物一–如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选择在扩增靶时产生荧光信号。切记！AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随–如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶得数量,则选SYBRGreenReagentsSYBRGreenSYBRGreen试剂包括两可在结合到双链DNA时产生荧光信号。SYBRGreen染料通常就是添加到反应得e将Standard(标准)选为升降温速度。AppliedBiosystems不提供SYBRGreen试剂得Fast母液。3)为升降温速度选择Standard(~2hourstopletearun)–如果为PCR反应使用Fast试剂,则选择Fast(~40MinutestoﻫCompleteaRun)(快速(约40分钟完成运行))、试剂),则选择Standard(~2HourstopleteaRun)(标准(约2小时4)为模板类型选择gDNA(genomicDNA)(gDNA(基因组DNA))。5)Next>(下一步)。在Targets(靶)屏幕上,输入您想在PCR反应板中定量得靶数量,然后1)单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinther将以您输入得数字更新。s建议反应板中得每个靶检测设置一条标准曲线、注意:SetUpStandards(设置标准品)复选框默认情况下已选取。–如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶得TaqMan探针得5′端,则–如果要将JOETM染料加在您用于检测靶得TaqMan探针得5′端,–如果要将VIC®染料加在您用于检测靶得TaqMan探针得5′端,则选择VIC、–如果您正使用SYBR®Green染料以检测双链DNA,则选择SYBR。c.从Quencher(淬火基团)下拉菜单中,选择NFQ-MGB(默认)。探针得3′端,则选择NFQ－MGB。–如果您正使用SYBRGreen染料,则选择None(无)。在Standards(标准品)屏幕上,为所有标准曲线输入反应板中得点数与1)单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandard建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint？(每a。单击EnterStartingQuantity(输入起始量)字段,然后输入应仔细为您得检测考虑标准品数量得适当范围:个对数级之间。如果您为标准品指定大范围得数量,您需使用PCR产物或高度浓缩得模板,如cDNA克隆。–如果您得cDNA模板数量有限且/或靶就是低拷贝数转录物,或已知在给定范围之内,则可能需要小范围得标准品数量。5)Next＞(下一步)。设置。rgetassay?(每个靶检测您需要多少阴性对照?),然后输入3、opb、保留Color(颜色)字段中得默认设置。mepopns–选择AllSample/TargetReactions(所有样本/靶反应)以检测所–选择SpecifySample/TargetReactions(指定样本/靶反应)以指7)在WellCount(反应孔数)窗格中,确认存在:8)在ViewPlateLayout(查瞧检测板布局)选项卡上:a。从ArrangePlateby(反应板布局方式)下拉菜单中,选择Rowsb。从PlaceNegativeControls(放置阴性对照)下拉菜单中,选择UpperLef(t左上角)(默认)、9)Next〉(下一步)、在RunMethod(运行方法)屏幕上,查瞧默认运行方法得反应体积与温d2)单击ReactionVolumePerWell(每个反应孔得反应体积)字段,然后输入25µL。。如果实验需要一个不同得温度变化过程设置,调整温度变化过程设置或用ﻫRunMethod(运行方法)库中得某个温度变化过程设置进行替换。RunMethod(运行方法)库包括在StepOne软件中。在ReactionSetup(反应设置)屏幕上,选择检测类型(如果使用TaqMan试剂),然后查瞧为准备PCR反应、标准稀释序列与样本稀释而计。完成ReactionMixCalculations(反应预混液计算)选项卡1)选择ReactionMixCalculations(反应预混液计算)选项卡(默认)。2)从SelectTarget(选择靶)窗格中,选择RNaseP。3)从AssayType(检测类型)下拉菜单中,选择Inventoried/MadetoOrder(库存/定制)。ppliedBiosystemsTaqManGeneExpressionA如果正使用PrimerExpress®软件设计检测,则选择Custom0µL之间得反应体积。包括额外反应体积以弥补移液过程中得损失。建议至少准备10％得额a、确认MasterMixConcentration(母液浓度)字段中显示2、0X。b、确认AssayMixConcentration(检测预混液浓度)字段中显1)选择SampleDilutionCalculations(样本稀释计算)选项卡、2)单击DilutedSampleConcentration(10XforReactionMix)4)查瞧为样本稀释计算得剂量。msStore(AppliedBiosystems产品仓库)、neNameRNaseP单击FindAssay(查找检测套件)、aDisplayAllItems,然后配合以下TaqMan®母液使用:TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix(2✕),NoAmpErase®TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,200次反应,编号TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG,2000次反应,编号10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAm4)靶DNA或cDNA有几种TaqMan与SYBRGreen试剂可用于定量实验、TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,200次反应,编号10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,编号TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,No,AmpErase®UNG,200次反应,编号seUNG编号TaqMan®PCRCoreReagentsKit,200次反应,编号N808-0228b。SYBR®Green试剂PowerSYBR®GreenPCRMasterMix(1mL),40次反应,编号PowerSYBR®GreenPCRMasterMix(5－mL),200次反应,编号PowerSYBR®GreenPCRMasterMix(10×5-mL),2000次反应,PowerSYBR®GreenPCRMasterMix(50mL),2000次反应,编号LSYBR®GreenPCRMasterMix(5—mL),200次反应,编号SYBR®GreenPCRMasterMix(50—mL),2000次反应,编号SYBR®GreenPCRCoreReagents,200次反应,编号9、完成设计向导要完成DesignWizard(设计向导)工作流程,查瞧反应板布局,然后1)在ReviewPlateforExperiment(查瞧实验得反应板)窗口中,查2)单击SaveExperiment(保存实验)。Save(保存)以接受默Home页)屏幕。在将样本添加到最终反应预混液之前执行样本稀释。采用StepOneTM软件计算得剂量稀释样本。(样本稀释计算)根据储液中得样品浓度？ng/µL,Stepone软件计算出稀释剂量、因为在L计算”表稀释样本。微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机lation2等算)根据储液中得标准品浓度？copies／µL,Stepone软件计算出剂量。用于稀释标准品得稀释液(TE缓冲液或水)、标准品储液微量离心管、移液枪、移液枪枪头、试管振荡器、离心机9)将标准品置于冰上,直到准备好反应板。若实验包括一个以上得靶检测,则为每个靶检测单独准备反应预混液头、离心机2)为反应预混液标记一个适当大小得反应管:ReactionMix、3)将所需剂量得每种组分添加到反应管中:母液(2、0X)12.5µL、检测母注意:将检测母液置于冰柜中避光储存,直到准备使用。过多暴露在光线下量。建议至少准备10％得超额量。反应管盖。5)短暂地离心反应管以除去气泡。注意:使用之前,请执行以下操作:,MicroAmpTMFastOptical48－WellReactionPlateMicroAmpTMOptical48-WellAdhesiveFilm(µL)x1水量(µL)3)对于每个重复组,准备标准品反应预混液:反应反应标准品反应预混液反应预混液标准品标准品剂管反应预剂量(µL)量(µL)1Std1Reactionm74、6Std18、3tdx3Std3Reactionmix74、6Std38、34Std4Reactionmi74、6Std48、3xPoPop28、34)对于每个重复组,准备未知样本得反应预混液:剂量(µL)管Reactionmix(µL)反应74、6b。5)用孔板高透光度盖膜密封反应板。线实验时:。或–使用AdvancedSetup(高级设置)工作流程更改软件中得反应板布局、llReactionPlate装载到StepOneTM扩增仪以准备运行、a、打开扩增仪抽屉b。将反应载体放置在样本加热块中、反应板得方向取决于您所用耗材得类.若使用一个反应板,让A1反应孔位于样本加热块得左后角、2、启动运行)2)单击STARTRUN(启动运行)。运行期间,定期查瞧StepOne软件提供得所有三条曲线就是否存在潜a。停止运行在StepOne软件中,单击STOPRUN(停止运行)。对话框中包括:–StopImmediately(立即停止)以立即停止运行。–StopafterCurrentCycle/Hold(当前循环/保持阶段后停止)以在–Cancel(取消)以继续运行。t板布局)选项卡中所选反应孔得数据。扩增曲线将对照归一化染料荧光(∆Rn)AmplificationPlot(扩增曲线)屏幕对识别与检查异常扩增十分有用。异常扩增可能包括以下情况:强。•预期循环中不存在可检测荧光(在相同情况下使用相同试剂从先前类似运行期间,TemperaturePlot(温度曲线)屏幕上实时显示样本加热块、受热护盖门与样本(已计算)得温度。t两条曲线存在显著偏差可能表示存在问题、•HeatedCover(受热护盖门)曲线应保持方法中指定得常温。偏离一d、在RunMethod(运行方法)屏幕上查瞧运行进度StepOneRunMethod(运行方法)屏幕上显得温度变化过程报告运行进度。更改运行方法(添加循环、保持或解链曲线)•在导航窗格中,单击RunMethod(运行方法)。•在RunMethod(运行方法)屏幕上,执行以下任意操作–若您想要将解链曲线阶段添加到运行得末尾,则选择ﻫAddMeltCurveStagetoEnd(将解链曲线阶段添加到末尾)、•单击SendtoInstrument(发送到扩增仪)One当StepOne扩增仪显示RunHistory(运行历史)屏幕时,从St1)当StepOne扩增仪触摸屏上显示RunReport(运行报告)屏幕时StepOneTM软件使用标准曲线定量方法分析实验数据。1、实验数据nts文件夹找到创建得试验设计打开实验数据文件单击Analyze(分析)a.ExperimentMenu(实验菜单)窗格－提供到以下软件屏幕得链接:•Setup(设置)屏幕–AmplificationPlot(扩增曲线)–StandardCurve(标准曲线)–RawDataPlot(原始数据曲线)QCSummary(QC摘要)MultiplePlotsView(多曲线视图)cView局或反应孔表要在分析屏幕上显示特定反应孔,在ViewPlateLayout(查瞧反应,操作如下:a、要选择某特定类型得反应孔,使用SelectWellsWith(选择反应孔类型)下拉菜单:选择Sample(样本)、Target(靶)或Task(任c、要选择多个反应孔,按住CTRL键并单击、或按住Shift键并单击反应板布局中得某反应孔并拖移鼠标覆盖所需得反应孔。d。要选择所有48个反应孔,单击反应板布局得左上角。3)如何显示多条曲线MultiplePlotsView(多曲线视图)。b、要显示四条曲线,单击∷Showplotsina2×2matrix(以示曲线)。c.要在两行中显示两条曲线,单击∶Showplotsintworows(以2、查瞧标准曲线StandardCurve(标准曲线)屏幕显示指定为标准品得样本得标准曲线、StepOne软件根据标准曲线计算未知靶得数量。在StandardCurve(标准曲线)屏幕上检查以下回归系数值:斜率/扩增效率值-扩增效率通过使用标准曲线中回归线得斜率来计算。R–标准品数量范围,为了获得更准确及更精确得效率测量值,使用大范围得–标准品重复数,为了获得更准确得效率测量值,包括重复数以降低移液R2值表示标准曲线回归线与标准反应得单个C数据点之间得拟合程T•CT值应中靶得数ﻫ量太少;对于C值〉35得情况,期望更高得标准偏差。T1)从ExperimentMenu(实验菜单)窗格中,选择Analysis(分析)ﻫStandardCurve(标准曲线)。注意:如果StandardCurve(标准曲线)屏幕中未显示数据,单击Analyze(分析)。2)在ViewPlateLayout(查瞧反应板布局)选项卡上单击反应板布StandardCurve上显示全部48个反应孔、3)从Target(靶)下拉菜单中,选择All(全部)。otlegend可接受范围之内:示例实验中,所有样本(蓝点)均在选择:Rn循环变化－∆Rn就是PCR运行生成得归一化荧光信号得T•Rn随循环变化－Rn就是归一化报告荧光染料。此曲线将Rn作为数。此曲线将阈值循环(CT)作为反应孔位置得函数显示。您可使用此曲线查②可在Ampli