丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备

丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备第1页，共40页，2023年，2月20日，星期三项目三丝氨酸羟甲基转移酶的电泳制备第2页，共40页，2023年，2月20日，星期三第1组第2组第3组第4组第5组第6组第7组第8组一、汇报交流方案第3页，共40页，2023年，2月20日，星期三二、讨论确定方案SDS制备SHMTSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是一种在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中加入SDS和巯基乙醇，以消除蛋白质分子所带的净电荷和形状对电泳迁移率影响的电泳技术。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中待检蛋白质的迁移率主要依赖于其相对分子质量，因此被广泛用于测定蛋白质的相对分子质量。第4页，共40页，2023年，2月20日，星期三十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，与蛋白质结合可形成蛋白质-SDS复合物，由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原来的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别。第5页，共40页，2023年，2月20日，星期三在聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中加入SDS和巯基乙醇，能掩盖不同蛋白质间的电荷差异，并引起蛋白质构象变化，从而导致变性后的蛋白质分子在凝胶电泳中的迁移率取决于其相对分子质量大小，而与其他因素（原有电荷、形状）无关。通过这种电泳方式可将细胞中所有蛋白质根据各自的相对分子质量大小而分离开来。第6页，共40页，2023年，2月20日，星期三电泳方向混合样品电泳带孔胶大分子小分子第7页，共40页，2023年，2月20日，星期三SHMT的电泳制备操作流程安装电泳槽剥胶电泳上样制胶染色第8页，共40页，2023年，2月20日，星期三三、关键操作试剂配制制胶剥胶第9页，共40页，2023年，2月20日，星期三四、方案实施清洁领取物料操作填写生产记录清场与清洁第10页，共40页，2023年，2月20日，星期三SHMT的电泳制备安装电泳槽剥胶电泳上样制胶染色第11页，共40页，2023年，2月20日，星期三材料：大肠杆菌培养物悬液（含SHMT）器材：（1）夹心式垂直板电泳槽；（2）直流稳压电源（电泳仪）；（3）培养皿及竹夹子；（4）长针头（8~10cm）及普通针头；（5）注射器（10ml）；（6）微量进样器（50μl）；（7）细长皮头吸管；（8）移液管架；（9）棕色试剂瓶；（10）白色试剂瓶；（11）1ml、2ml、5ml吸量管；（12）卷纸1包；（13）大平皿，（14）移液枪（配20μl枪头）。（一）材料与仪器第12页，共40页，2023年，2月20日，星期三夹心垂直板电泳槽示意图1：导线接头2：下贮槽3：凹形橡胶框4：梳子5：固定螺丝6：上贮槽7：冷凝管凝胶模示意图1：梳子2：长玻璃板3：短玻璃板4：凹形橡胶框第13页，共40页，2023年，2月20日，星期三第14页，共40页，2023年，2月20日，星期三（二）试剂及配制（1）30%丙烯酰胺储存液称取丙烯酰胺29g、甲叉双丙烯酰胺1g，加热至37℃溶解，蒸馏水定容至100mL，装于棕色瓶，4℃保存。（2）1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）缓冲液称取Tris18.17g，加蒸馏水溶解，浓盐酸调pH至8.8，定容至100mL。（3）1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）缓冲液称取Tris12.12g，加蒸馏水溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL。第15页，共40页，2023年，2月20日，星期三（4）10%SDS溶液称取SDS10.0g，加蒸馏水，68℃助溶，定容至100mL。（5）10%过硫酸铵溶液称取1.0g过硫酸铵，加水定容至10mL，4℃保存。（6）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）称取Tris15.1g、甘氨酸94g、SDS5g，加水定容至1L，室温存放，使用时稀释5倍使用。第16页，共40页，2023年，2月20日，星期三（7）考马斯亮蓝R250染色液在45mL甲醇、45mL水和10mL冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用滤纸过滤染液以去除颗粒状物质。配制500mL。（8）脱色液75mL冰乙酸，50mL甲醇，875mL水，混匀即可。（9）2×SDS凝胶加样缓冲液配5mL：取1mol/LTris-HCl（pH6.8）0.5mL，SDS0.2g，溴酚兰10mg，甘油1mL，加水定容至5mL，与样本混匀前加0.16gDTT。使用时与样本l∶1（v/v）混匀。第17页，共40页，2023年，2月20日，星期三（10）样品处理大肠杆菌培养物悬液→离心（3000r/min，5min）→蒸馏水悬浮细胞→加2×SDS加样缓冲液（1:1）→沸水加热10min→离心（5000r/min，10min）→取上清液加样。第18页，共40页，2023年，2月20日，星期三（三）操作步骤（1）将长、短玻璃板分别插到凹形橡胶框的凹形槽中。温馨提示：注意勿用手接触灌胶面的玻璃。（2）在长玻璃板下端与橡胶模框交界的缝隙处加入已融化的1%琼脂，封住空隙。温馨提示：封底用的琼脂应用1×TBE溶解，凝固后的琼脂中应避免有气泡。（3）将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。（4）将下贮槽的螺孔对准已装好螺丝钉的上贮槽，旋紧螺丝帽，竖直电泳槽。温馨提示：安装电泳槽，双手以对角线的方式旋紧螺丝帽，以免缓冲液渗漏。1.电泳槽组装第19页，共40页，2023年，2月20日，星期三（三）操作步骤2.胶体的制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围

凝胶浓度（%）线性分离范围（kD）1512～431016～687.536～945.057～212第20页，共40页，2023年，2月20日，星期三（1）分离胶的制备

SDS%分离胶配方

溶液成分不同体积（mL）凝胶液中各成分所需体积（mL）510152025304050蒸馏水1.63.34.96.68.29.913.216.530%丙烯酰胺溶液2.04.06.08.010.012.016.020.01.5mol/LTris（pH8.8）1.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02按表配制12%分离胶，混匀后迅速将配好的分离胶倒入凝胶模长、短玻璃板间的间隙内，高度约8cm。然后沿长玻璃板板壁缓慢注入少许蒸馏水，进行水封。待凝胶完全聚合（约30min），倾去水封层的蒸馏水，并用滤纸条吸去残余水分。温馨提示：若凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。第21页，共40页，2023年，2月20日，星期三（2）浓缩胶的制备

SDS%浓缩胶配方

按配制5%浓缩胶，混匀后迅速加到已聚合的分离胶上方（高度以插入梳子不溢出为宜），轻轻将梳子插入浓缩胶内，待凝胶完全聚合（约30min）后小心拔去梳子。温馨提示：丙稀酰胺为神经毒剂，使用时要小心，操作务必戴手套。过硫酸铵需新鲜配制，并注意浓度，否则影响胶凝固。残余胶液可暂时留存，便于参考胶凝固时间。溶液成分不同体积（mL）凝胶液中各成分所需体积（mL）123456810蒸馏水0.681.42.12.73.44.15.56.830%丙烯酰胺溶液0.170.330.50.670.831.01.31.71.0mol/LTris（pH6.8）0.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01第22页，共40页，2023年，2月20日，星期三3．上样

（1）将Tris-甘氨酸电泳缓冲液倒入上、下贮槽中，高度应没过短玻璃板约0.5cm。（2）用微量注射器吸取10～20μL样品液加入上样孔，加样体积可根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握。温馨提示：若样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除；加样时，微量注射器针头应尽量接近加样槽底部，但针头勿碰破凹形槽胶面。（三）操作步骤第23页，共40页，2023年，2月20日，星期三4．电泳连接电泳仪，打开电源，按8V/cm确定所需电压，待指示剂（溴酚蓝）进入分离胶后将电压提高到15V/cm，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约3h），停止电泳，关闭电源。温馨提示：正极应接下槽。（三）操作步骤第24页，共40页，2023年，2月20日，星期三5．剥胶电泳结束后，取下凝胶模，卸下橡胶框，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，切角作记号。温馨提示：剥离凝胶应戴手套，防止污染胶面。（三）操作步骤第25页，共40页，2023年，2月20日，星期三6．染色经SDS分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝R250染色。（1）染色将凝胶浸泡在染色液中，在室温下缓慢摇动染色30min。（2）脱色回收染色液，凝胶先用蒸馏水漂洗一次，再浸入脱色液中，放在脱色摇床上于室温平缓摇动3～5h，其间更换脱色液3～4次，直至条带清晰。（3）漂洗脱色后，用蒸馏水漂洗凝胶3～5次。（三）操作步骤第26页，共40页，2023年，2月20日，星期三五、结果展示与评价SDS-PAGE电泳示意图1：对照2：样品M：蛋白质Marker12M第27页，共40页，2023年，2月20日，星期三1、SHMT2、电泳3、电泳技术4、PAGE5、SDS6、IFE六、总结与拓展第28页，共40页，2023年，2月20日，星期三1、SHMTSerinehydroxymethyltransferase丝氨酸羟甲基转移酶glyA第29页，共40页，2023年，2月20日，星期三2、电泳电泳是指带电粒子在电场中的运动。带电粒子（带电颗粒）在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis)。第30页，共40页，2023年，2月20日，星期三3、电泳技术利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。利用电泳现象使物质分离的技术称为电泳技术。不同物质由于所带电荷、分子大小和形状不同，在电场中的移动速度不同。

第31页，共40页，2023年，2月20日，星期三4、PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis

聚丙烯酰胺凝胶电泳

以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的电泳技术广泛用于蛋白质、酶、核酸等生物大分子的分离、制备及定性、定量分析。第32页，共40页，2023年，2月20日，星期三聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。丙烯酰胺单体和N，N'-甲叉双丙烯酰胺单独存在或混合存在时是稳定的，当遇到自由基时，二者发生聚合反应形成三维网状结构的凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的聚合体系有化学聚合和光聚合两种。第33页，共40页，2023年，2月20日，星期三聚合方式催化剂加速剂聚合条件凝胶特点化学聚合过硫酸铵（AP）N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺（TEMED）碱性环境胶孔径较小，多用于制备分离胶光聚合核黄素（VB2）无光胶孔径较大，不稳定多用于制备浓缩胶第34页，共40页，2023年，2月20日，星期三聚丙烯酰胺凝胶的优点

①在一定浓度时，胶体透明，有弹性，机械性能好。②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。③对pH和温度变化较稳定。④几乎无电渗作用，只要丙烯酰胺单体纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好。⑤样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g。⑥凝胶孔径可调节，根据被分离物质的相对分子质量，改变单体及交联剂的浓度可调节凝胶的孔径。⑦分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。

第35页，共40页，2023年，2月20日，星期三凝胶浓度和交联度是影响聚丙烯酰胺凝胶性能的主要因素。通常用100mL凝胶溶液中含有Acr及Bis的总克数表示凝胶浓度（T%）。交联度（C%）是指交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百分数。一般分离蛋白质和核酸的聚丙烯酰胺凝胶标准浓度分别为7.5%和2.4%