第四章-氨基酸-肽和蛋白质

第四章氨基酸、肽和蛋白质主要内容第一节氨基酸第二节肽第三节蛋白质第四节氨基酸及蛋白质的纯化和鉴定——蛋白质的构件分子氨基酸第一节氨基酸实验证据蛋白质和多肽的肽键可被催化水解酸/碱能将蛋白完全水解

酶水解一般是部分水解得到各种AA的混合物得到多肽片段和AA的混合物构成蛋白质的AA只有20余种，且都是α-氨基酸。除甘氨酸外，19种AA都具有旋光性。除胱氨酸和酪氨酸外，其余AA都能溶于水。氨基酸排列方式的多样性决定了蛋白质的多样性,从而决定生物界的多样性!结构通式氨基酸的定义按Ｒ基的化学结构分类：１、脂肪族aa：中性、含羟基或硫、酸性aa及其酰胺、碱性aa一、氨基酸的分类２、芳香族aa３、杂环aa按Ｒ基的极性性质分类：１、非极性Ｒ基aa２、不带电荷的极性Ｒ基aa3、带正电荷的Ｒ基aa4、带负电荷的Ｒ基aa二、氨基酸的酸碱性质（一）兼性离子H3N—CH—COOHR+（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+（pH=pI）H2N—CH—COO-R（pH＞pI）（二）氨基酸的解离（三）氨基酸的等电点当溶液为某一pH值时，AA主要以兼性离子的形式存在，分子中所含的正负电荷数目相等，净电荷为0。这一pH值即为AA的等电点（pI）。在pI时，AA在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于两性离子状态。Ka1*Ka2=……pI=(pK’1+pK’2)/2侧链不含离解基团的中性AA甘氨酸滴定曲线pI

取决于两性离子(兼性离子)两边pK’值的算术平均值酸性AA：pI=(pK’1+pK’R-COO-

)/2碱性AA：pI=(pK’2+pK’R-NH2)/2对于侧链含有可解离基团的AA（四）氨基酸的甲醛滴定原因原理应用

NH2OHRCHCOOH+HNO2RCHCOOH+H2O+N2VanSlyke

法测氨基氮（体积）的基础，N2中的1/2为氨基氮。

氨基酸定量和蛋白质水解程度测定原理。1.与亚硝酸反应（一）α-氨基参加的反应三、氨基酸的化学性质最经典、最易进行的亲核取代反应之一丹磺酰氯：用于多肽N末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定！2.与酰化试剂反应NO2FO2N+H2N—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱碱性DNP-氨基酸（黄色）DNFBSanger法测定N末端氨基酸基础3.烃基化反应—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3无水HF苯异硫氰酸酯PITC苯氨基硫甲酰衍生物苯乙内硫脲衍生物Edman降解法基础

R’COOHR’COOC=O+H2NCHC=NCHHRHR醛氨基酸Schiff’s碱-H20+H204.形成希夫碱反应在生物体内经AA氧化酶催化即脱去α-氨基而转变为酮酸。5.脱氨基反应（2）成酯

NH2

干燥，HCl

RCHCOOH+C2H5OH

回流

RCHCOOC2H5+H2ONH3·Cl保护羧基（1）与NaOH等形成盐（二）α-羧基参加的反应1.成盐或酯反应

HN-保护基R—CH-COOH+PCl5

HN-保护基

R—CH-COCl+POCl3+HCl活化羧基2.成酰氯反应

NH2

脱羧酶

R—CH-COOHR-CH2-NH2+CO23.脱羧基反应

YNHONH2NH2

R—CH—C—OCH3

YNHOHNO2

R—CH—C—NHNH2

YNHO

R—CH—C—N-—N+N+2H2O

肼酰化氨基酰肼酰化氨基酰叠氮肽的人工合成4.叠氮反应（三）羧基和氨基都参加的反应1、成肽反应2、与茚三酮的反应及其应用特异性显色及测定Tyr酚基在3和5位上易发生亲电取代反应，如碘化和硝化黄色反应1、酪氨酸Tyr（四）侧链R基参加的反应Tyr与重氮苯磺酸生成橘黄色化合物，用于检测酪氨酸Pauly反应精氨酸Arg侧链胍基与环己二酮生成缩合物2、碱性AA色氨酸Trp侧链吲哚基能被N-溴代琥珀酰亚胺氧化——分光光度法测定Trp含量甲硫氨酸Met侧链上甲硫基：强亲核基团与烃化试剂成锍盐保护巯基3、含硫AA半胱氨酸Cys的巯基不稳定，易被氧化成二硫键，二硫键可被氧化剂（过甲酸）以及还原剂（巯基化合物）打开。磺基丙氨酸与二硫硝基苯甲酸发生硫醇-二硫化物交换pH8.0时412nm最大光吸收—分光光度法测定-SH四、AA构型和光谱性质（一）AA构型天然AA主要为L构型。（二）氨基酸的光谱性质紫外吸收光谱可见光区：无吸收远紫外和红外区：都吸收近紫外区（200—400nm）：酪氨酸Tyr/色氨酸Trp/苯丙氨酸Phe

原因：芳香族氨基酸

不饱和体系Trp280nmTyr275nmPhe257nm蛋白质含量测定280nm（一）肽和肽键的结构第二节肽①肽键中C-N键有部分

双键性质

——不能自由旋转②组成肽键原子处于同一平面（肽平面）③键长及键角一定④大多数情况以反式

结构存在（一）肽和肽键的结构共价主链

（二）肽的物理化学性质肽末端α-羧基pKa值比游离AA中的大。肽末端α-氨基pKa值比游离AA中的小。等电点（两性）。酸碱性质取决于：

—α-羧基、α-氨基、侧链基团的解离肽的物理性质肽的化学性质1与氨基酸相似之处•酸、碱性：以内盐形式存在，有等电点。•-COOH：脱羧反应。2与氨基酸的区别氨基酸多肽（n≥3）：缩二脲反应—紫色（缩二脲反应）硫酸铜，OH-•-NH2：与亚硝酸反应、酰化反应等。1谷胱甘肽（γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸）谷胱甘肽，GSH，具有解毒功能，也是细胞内的重要还原剂。（三）天然多肽举例2血管紧张肽Ⅱ

存在于血液中的一种激素，名叫血管紧张肽Ⅱ，能调节血压，系八肽结构3催产素

由垂体后叶分泌的催产素则为九肽，临床上主要用于产后子宫收缩不良和产后子宫出血，某些条件下也可用于催产。1838年，J.J.Berzelius提出，由proteios衍生而来

——第一重要、首要的物质第三节蛋白质一、蛋白质通论（一）蛋白质的化学组成和分类１、元素组成２、蛋白质的含氮量蛋白氮占生物组织所有含氮物质的绝大部分。大多数蛋白质含氮量接近于16%

蛋白质含量=每克样品中含氮的克数6.25凯氏定氮法：３、蛋白质的分类（1）依据外形分类球状蛋白质纤维状蛋白质膜蛋白质

（2）依据蛋白质的组成分类简单蛋白结合蛋白（二）蛋白质的大小与分子量“前提”：对任一种给定的蛋白质，其所有分子在AA组成和顺序以及肽链的长度方面都应是相同的，即所谓均一的蛋白质。蛋白质是分子量很大的生物分子蛋白质与多肽无严格的界线

——通常将6000Dr以上的多肽称为蛋白质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质——月示——胨——多肽——肽——AA1*1045*1032*1031000200100-500（三）蛋白质的理化性质蛋白质的分子大小和形状蛋白质是高分子化合物蛋白质分子的扩散和沉降蛋白质的粘度

蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性碱/酸越大——pI越大pI通常在6.0左右蛋白质的两性电离及等电点（四）蛋白质构象和结构的组织层次结构层次二、蛋白质的分子结构（一）一级结构（二）二级结构

1、α-螺旋

α-螺旋结构要点：多肽链主要骨架围绕螺旋中心轴螺旋式上升，每转一圈上升3.6个氨基酸残基，向上平移5.4Å，每个氨基酸残基沿轴上升1.5Å；相邻的“螺旋圈”之间形成链内氢键，即每一个肽单元的N-H与前面隔三个肽单元的C=O形成氢键，氢键的取向与螺旋中心轴几乎平行，通常所有的肽键都参与氢键的形成。α-螺旋构象靠氢键维持，若破坏氢键，α-螺旋构象破坏，肽链松散。

2、-折叠-折叠结构要点：肽链呈现平行折叠延伸结构。肽链各肽键的氨基与羰基氧原子之间形成氢键。3、-转角和无规卷曲-转角无规卷曲用来阐述没有确定规律性的那部分肽链结构。二级结构形成类型的决定因素：

肽段上氨基酸残基侧链的长短。（1）R基小，且不带电荷的AA,易形成α-螺旋。例如：多聚Ala；（毛发中的角蛋白整条链为α-螺旋）（2）R基太短，却难以盘曲，只能折叠成片层状，例如：蚕丝蛋白含45%甘和32%丙，故有大量片层结构存在；（3）R基太大，不易形成螺旋状或折叠成片层，而呈无定形线状结构。例如：异亮、色和苯丙等，侧链紧靠排列在一起时，由于肽空间障碍较大。（三）三级结构在α-螺旋、β-折叠以及无定形线状等二级结构基础上，受侧链以及各主链构象单元间的相互作用，从而进一步卷曲、折叠成具有一定规律性的三维空间结构，称为蛋白质的三级结构。大多数蛋白质都具有纤维状或球状的三级结构。

肌红蛋白(Mb)N端

C端纤连蛋白分子的结构域结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。

有些蛋白质由两条或两条以上具有三级结构的多肽链构成。每条具有三级结构的多肽链就称为一个亚基。多个亚基通过非共价键（氢键、盐键、疏水键等键）聚合而成一定空间结构的聚合体，称蛋白质的四级结构。（四）四级结构亚基是肽链但肽链不一定是亚基。

血红蛋白，由两条α-链（α-亚基）和两条β-链（β-亚基）构成的α2β2四聚体。每个亚基由一条多肽链和一个血红素组成。四级结构反映蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基间的相互作用，但不包括亚基内部的空间结构。示例蛋白结构详见第5章（五）蛋白质分子中的副键

1、氢键；2、盐键；3、疏水键；4、二硫键1.氢键由分子中与电负性较强的原子相结合的氢原子（例N-H）和氧（例C=O）及氮等原子相互吸引而成。二级结构主要依赖于氢键的作用，可存在于一条肽键的两圈α-螺旋之间，或存在于两条肽键之间（β-折叠），氢键的键能很小，属微弱的次级键，但由于多肽链中所有的氨基酸残基都可形成氢键，因此量多，从而使氢键成为维持蛋白质空间结构的重要副键。用浓尿素或胍溶液破坏氢键时，可破坏其空间构象，从而使多肽链松散开来。2.盐键

由正负离子内的静电吸引所形成的化学键。蛋白质分子中有大量的极性氨基酸，如Asp、Glu带负电荷COO-；Arg，Lys，His带正电荷-NH3+，两者之间通过静电吸引形成离子键（盐键）。绝大多数分布在蛋白质分子表面，使蛋白质易溶于水或具有两性电离的性质。3.疏水键

氨基酸侧链上的非极性基团在溶液中，为了避开水相，相互间群集在一起而成的作用力，疏水基团之间的作用力。例如色氨酸的吲哚环和支链氨基酸的-R基都属于非极性基，它们具有疏水性，在水溶液中，它们脱离水分子而趋向于蛋白质分子内部，以形成疏水基团之间的作用力。疏水键在维持蛋白质三级结构的稳定性上起着重要作用。4.二硫键（键能很大）

由两个半胱氨酸的-SH氧化脱氢，以-S-S-相连而成，二硫键可将不同肽链或同一条肽键的不同部分连接起来，对稳定蛋白质的构象起着重要作用。二硫键一旦破坏，蛋白质生物活性就丧失。三、蛋白质功能的多样性1.催化功能-酶2.调节功能-激素、基因调控因子3.转运功能-膜转运蛋白、血红/血清蛋白4.贮存功能-乳、蛋、谷蛋白5.运动功能-鞭毛、肌肉蛋白6.结构成分-皮、毛、骨、牙、细胞骨架7.支架作用-接头蛋白8.防御功能-免疫球蛋白9.异常功能

同源蛋白质：来自不同生物体、

执行同一/相似功能的蛋白质

同种蛋白质：来自相同生物体、

执行同一功能的蛋白质

1、同源蛋白质四、蛋白质的AA序列与生物进化（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化一百多个AA残基

MW约12.5×103

28个不变残基

细胞色素C的AA序列差异可用于核对各物种间的分类学关系以及绘制系统树/进化树。

2、细胞色素C与系统树invariantresidues(yellow)conservativesubstitutions(blue)nonconservativeorvariableresidues(unshaded)Conservationandvariationofcytochromecsequences1、氧合血红蛋白（二）同源蛋白质具有共同的进化起源该酶类活性中心的Ser残基起关键作用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶、凝血酶和纤溶酶有序列同源性对底物偏爱不同2、丝氨酸蛋白酶类卵清中的溶菌酶（lysozyme）α-乳清蛋白（lactalbumin）——三级结构很相似也可能具有共同的祖先。3、一些功能差异很大的蛋白质（一）肽的人工合成

保护（氨基、羧基、侧链活性基团）

活化（氨基、羧基）

缩合剂

（二）胰岛素的人工合成

（三）固相肽合成五、肽与蛋白质的人工合成第四节氨基酸及蛋白质的纯化和鉴定蛋白质分离纯化的一般原则总目标：增加制品纯度或比活前处理：因动/植物/细菌而异粗分级分离：采用盐析/等电点沉淀/有机溶剂分级分离等方法细分级分离：采用凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等结晶一、前处理依样品而定，方法多种多样。（一）沉淀法【溶解度差别】二、粗分级分离蛋白质从胶体溶液中沉淀析出【分离】胶体性质胶体溶液的特点：分子直径在1-100nm内溶于水不易聚集沉淀大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液蛋白质胶体溶液的稳定因素：1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥2.水膜弹性蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷Pr结构和性质没有变化适当条件下可重新溶解盐析法、有机溶剂沉淀法和pI沉淀法等（1）可逆沉淀【非变性沉淀】：盐析法加入中性盐脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶原因？盐溶—盐析分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中盐溶盐析向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出原因？蛋白质脱去水化层而聚集沉淀盐析（（NH4）2SO4）有机溶剂沉淀脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用等电点沉淀蛋白溶液的pH值=蛋白的pI值调整溶液pH，不同蛋白在各自pI处依次沉淀强烈沉淀条件破坏Pr胶体溶液稳定性也破坏Pr结构和性质沉淀不能再重新溶解如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐和生物碱沉淀等（2）不可逆沉淀【变性沉淀】重金属盐沉淀与带负电荷蛋白质结成不溶性盐生物碱试剂和某些酸类沉淀与带正电荷蛋白质生成不溶性盐加热变性沉淀天然结构解体，疏水基外露，破坏水化层及带电状态

【根据分子大小不同】利用蛋白质分子不能透过半透膜将其与小分子物质分开半透膜为玻璃纸或纤维素材料（二）透析和超过滤血液透析小分子溶出小分子被带出透析机透析液加压血液（三）超速离心

超速离心法既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。高速：25000rpm超速：50000-120000rpmCsCl密度梯度离心蔗糖密度剃度离心（四)根据电荷不同的分离方法—电泳原理：蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0分子大小不同，电场中移动速度也不同SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量巯基乙醇破坏二硫键蛋白质颗粒电泳时迁移率取决于：所带电荷分子量分子形状等电聚焦电泳（IEF）

通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。

双向凝胶电泳双向电泳毛细管电泳

毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。毛细管电泳层析技术氨基酸分离纯化的层析技术蛋白质分离纯化的层析技术三、细分级分离{层析系统固定相{流动相附着在固相上的液体固体氨基酸分离纯化的层析技术

（1）分配层析法的一般原理

——利用AA成分分配系数的差异{气体液体吸附固体吸附能力不同分配液体分配系数不同离子交换离子交换剂亲和性不同凝胶多孔凝胶，通过速度不同亲和固定相只能与一种组分结合，——分开其它无亲和力的组分

按层析原理分：固定相各组分对固定相柱固定相装于柱内纸固定相是液体，吸附在滤纸上，将样品点在纸上，用流动相展开薄层将有适当粘度的固定相涂在薄板上薄膜与纸层析相似，纸用其它高分子有机吸附剂代替

按操作形式分：分配柱层析离子交换层析纸层析薄层层析气液层析高效液相层析蛋白质分离纯化的层析技术层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的(称为固定相)，另一个相则流过此固定相(称为流动相)并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离吸附层析是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。

溶剂洗脱法置换洗脱法前缘洗脱法吸附层析分配层析详见：氨基酸的分离纯化的层析技术分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，层析系数是一常数。离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质（母体）上引入若干可解离基团（活性基团）而制成。按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。离子交换层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种