免疫磁珠荧光量子点技术检测结核分枝杆菌

免疫磁珠荧光量子点技术检测结核分枝杆菌马慧;高诗会;杨华;王祎龙;胡忠义;秦莲花;陈海珍;陆俊梅;王洁;柏文娟;郭琪【摘要】目的筛选结核分枝杆菌(MTB)免疫磁珠荧光量子点检测方法的最佳配体组合•方法将本室筛选获得的MTB结合肽H8和商业化抗MTB多克隆抗体(Pab)与纳米磁珠偶联，多肽H8、商业化抗MTB单克隆抗体(Mab)和抗热休克蛋白65单克隆抗体(Mabe)与荧光量子点偶联，分别获得2种免疫磁珠和三种功能化荧光量子点,两两组合用于MTB检测，通过显微镜下观察荧光信号以及激光诱导荧光仪测量荧光值,判断不同配体组合与MTB的亲和性及特异性，获得最佳组合及其检测下限•结果偶联Mabe的荧光量子点与免疫磁珠MNP-Pab组合检测MTB结果为阴性，其余5组均为阳性•测量荧光值，检测效果较好的两组组合分别是MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8,阳性荧光值与阴性对照组比值分别是4.394和3.956,检测下限均是102条菌/mL.6组组合与12种非结核分枝杆菌(NTM)的亲和性各异，而与3种非分枝杆菌均不结合•结论MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8两组检测效果较好，与MTB亲和性较高,特异性较好,可作为MTB免疫磁珠荧光量子点检测技术的最佳配体组合.％TheaimsofthisstudyistoselectthebestligandeombinationsofimmunomagnetiebeadsandfluoreseentquantumdotsmethodfordeteetingMyeobaeleriumtubereulosis(MTB).MTB-speeifiepeptideH8andeommereialanti-MTBpolyelonalPabwereeombinedwithmagnetienanopartieles,whilethepeptideH8andtwoeommereialanti-MTBmonoelonalantibodies(MabandMabe)wereeoatedwithfluoreseentquantumdots,toobtainetwokindsofimmunomagnetiebeadsandthreekindsoffunetionalizedfluoreseeneeqantumdotseparately.Theresultsshowthatanti-MTBmonoelonalantibodiesMabecoatedQDscombinedwithMNP-Pabwasnegative,otherfivecombinationsdetectedMTBwereallpositive.ThebesttwocombinationswereMNP-Pab+QD-H8andMNP-H8+QD-H8,andtheratioofthefluorescencevaluebetweentheexperimentalgroupandthecontrolgroupwere4.394and3.956.Sixgroups,thelimitdetectionofthetwogroupswereall102CFU/mL.Sixgroupsdetectedtwelvekindsofnontuberculosismycobacteriumshoweddifferentaffinity,andhadnotaffinitywiththreekindsofnon-mycobacterium.ThecombinationofMNP-Pab+QD-H8andMNP-H8+QD-H8hadbetteraffinityandspecificity,couldbeusedasthebestligandcombinationsforimmunomagneticbeadsquantumdotsmethodtodetectMTB.期刊名称】《中国人兽共患病学报》年(卷),期】2013(029)005【总页数】6页（P466-471）【关键词】免疫磁珠;荧光量子点;分枝杆菌;结核;检测;配体【作者】马慧;高诗会;杨华;王祎龙;胡忠义;秦莲花;陈海珍;陆俊梅;王洁;柏文娟;郭琪【作者单位】同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;苏州大学基础医学与生物科学学院,苏州,215123;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学先进材料与纳米生物医学研究院,上海,200092;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;山西省儿童医院医学检验中心,太原,030013;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433;同济大学附属上海市肺科医院结核病诊疗中心,上海市结核病（肺）重点实验室,上海,200433【正文语种】中文【中图分类】R378结核病仍是威胁人类健康的主要传染病，目前市售的抗结核分枝杆菌（M.tuberculosis,MTB）抗体的特异性和敏感性均不高，因此，国内外均在寻找新的MTB标识物，建立检测MTB新方法［1-2］。近年来，纳米技术已经广泛用于普通细菌的检测中［3］，在MTB检测中也开展了一些研究［4］，我们利用前期筛选获得的MTB结合肽H8分别与纳米磁珠和荧光量子点偶联，建立了免疫磁珠荧光量子点技术检测MTB方法，但是该方法的特异性和灵敏度还有待于进一步提高，其中最关键就是获得互补的高亲和力高特异性检测配体组合。本研究将本室利用噬菌体展示技术筛选获得的MTB结合肽H8和市售抗MTB多克隆抗体（Anti-MycobacteriumtuberculosisPolyclonalAntibody,Pab）与纳米磁珠偶联，结合肽H8和市售抗MTB单克隆抗体（Anti-MycobacteriumtuberculosisMonoclonalAntibody,Mab）、抗MTB热休克蛋白65单克隆抗体（anti-HSP65Monoclonalantibody,Mabc）与荧光量子点偶联，获得2种免疫磁珠和3种功能化荧光量子点，六种组合用于MTB检测，比较不同组合的检测效果和特异性，并初步评价6组组合的检测下限，为优化MTB免疫磁珠荧光量子点检测技术奠定了基础。1材料与方法材料1.1.1菌株MTB标准株（H37RvATCC27294）和12种非结核分枝杆菌标准株（Nontuberculusmycobacterium，NTM）（田鼠分枝杆菌ATCC19422、新金色分枝杆菌ATCC25795、戈登分枝杆菌ATCC14470、不产色分枝杆菌ATCC19530、耻垢分枝杆菌ATCC19420、龟-脓肿分枝杆菌ATCC19977、偶发分枝杆菌ATCC6841、金色分枝杆菌ATCC23366、堪萨斯分枝杆菌ATCC12478、浅黄分枝杆菌ATCC43909、爱知分枝杆菌ATCC27280和草分枝杆菌ATCC11758）均购自国家菌种保藏中心，由上海市肺科医院保存。3种非分枝杆菌（铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC29213、大肠杆菌ATCC25922）为上海市肺科医院检验科保存的标准菌株。MTB结合肽H8MTB结合肽H8（序列：WHSGTPH）是本室以H37Rv灭活菌体为靶分子，应用噬菌体展示随机7肽文库进行筛选，通过耻垢分枝杆菌灭活菌体反筛获得［5］，委托上海波泰生物技术有限公司合成。1.1.3抗体抗MTB热休克蛋白65单克隆抗体（Mabc）、抗MTB单克隆抗体（Mab）和抗MTB多克隆抗体（Pab）购自美国Thermo公司。1.1.4主要仪器荧光显微镜（LeicaTCSCP5口）购自日本Olympus公司，细菌比浊仪（PhoenixSpecNephelometer）购自美国BectonDikinson公司，激光诱导荧光仪（SP-800MCE）由同济大学纳米院与上海光谱有限公司共同研制。方法1.2.1菌株制备将MTB标准株H37Rv和12种NTM标准株转种至含10%OADC营养添加剂的米氏7H9液体培养基中，37。C培养至对数生长期，IxPBS洗涤菌体2次，加入IxPBS和直径3mm的玻璃珠数个，振荡器振荡0.5min，吸取上清菌液用比浊仪比浊至相当于3x107细菌/mL[6],80。C水浴灭活30min待检。3种非分枝杆菌均从血平板上刮取生长良好的菌落,1xPBS洗涤菌体2次，磨菌后比浊至1个麦氏单位，80。C水浴灭活30min待检。1.2.2免疫磁珠制备参照文献[7]，分别取合成的纳米磁珠(Magneticnanoparticles,MNP,30mg/mL)33.3pL,用IxPBS洗涤3次，通过磁铁吸附沉淀。沉淀重悬于(200pL)1xPBS中，然后加入配好的碳化二亚胺盐酸盐[1－ethyl－3－(3－dimethylaminopropyl)carbodiimide(ethyldimethlaminopropylcarbodiimide)，EDC]/PBS(4mg/mL)，2min后再加入多肽H8(10mg/mL)或抗体Pab(4-5mg/mL),室温翻转2.5h，随时观察。通过磁铁吸附沉淀,1xPBS洗涤沉淀两次，除去未与磁珠偶联的多肽或抗体，沉淀重悬于BSA/PBS中即得到免疫磁珠，本研究中获得两种免疫磁珠MNP-H8和MNP-Pab。1.2.3功能化荧光量子点制备参照文献[8]，分别取荧光量子点(Quantumdots,QD,10mg/mL)150pL与多肽H8(10mg/mL)、抗体Mabc(100pg/mL)和抗体Mab(100pg/mL)(均20pL)混合，吹打，然后加入新配制的EDC/PBS溶液，吹打，静置2.5h，每隔0.5h吹打1次。12000r/min离心5min,1xPBS洗涤1次，沉淀重悬于BSA/PBS中，获得3种功能化荧光量子点QD-H8、QD-Mabc和QD-Mab。1.2.4MTB检测将免疫磁珠(MNP-Pab和MNP-H8)、功能化荧光量子点(QD-H8、QD-Mab和QD-Mabc)分别调整浓度为100pg/mL,两两组合(共6种组合)用于MTB标准株H37RV检测。检测时，取1个麦氏单位的H37Rv50pL、免疫磁珠和功能化荧光量子点各50pL加入1.5mL离心管内混匀，室温温和振荡作用2h，通过磁力架吸附沉淀，用1xPBS洗涤沉淀2次，沉淀重悬于30pL1xPBS中，取10pL涂片，显微镜下观察荧光信号；余下的20pL稀释到总体积300pL用于激光诱导荧光仪检测荧光值，功能化荧光量子点与免疫磁珠单独作用作为阴性对照，实验组与阴性对照组比值大于等于2.1判断结果为阳性[9]。1.2.5特异性检测将上述6种组合用于12种NTM标准株和3种非分枝杆菌检测，初步评价6种组合的特异性。1.2.6下限检测将比浊至3x107的H37RV进行10倍梯度稀释，分别用于6组组合下限检测。2结果6种组合检测MTB6种组合检测H37RV时荧光显微镜下均可见红色荧光，如图1所示，图中可以看出免疫磁珠MNP-H8和MNP-Pab与功能化荧光量子点QD-H8组合检测时，显微镜下荧光信号较强；测量荧光值结果，组合MNP-Pab+QDH8检测阳性值与阴性对照组比值最大，比值为4.394，组合MNP-H8+QD-H8和MNP-Pab+QDMab检测结果次之，阳性与阴性对照比值分别是3.956和3.459，6种组合检测结果见表1。图16种组合检测H37Rv显微镜下观察结果（x400）Fig.1ResultsforthesixcombinationsdetectionofH37Rvunderthemicroscope表16组组合检测H37Rv的结果Tab.1ResultsofsixcombinationsonH37RvdetectionQD-H8QD-MabcQD-MabMNP-Pab4.3941.9803.459MNP-H83.9562.4822.4556种组合检测3种非分枝杆菌上述6种组合检测3种非分枝杆菌，显微镜下均观察不到红色荧光（以组合MNP-H8+QD-H8检测铜绿假单包菌为例，见图2，测量荧光值低于阴性对照组荧光值或者是负值。图2组合MNP-H8+QD-H8检测铜绿假单胞菌显微镜观察结果（x400）Fig.2ResultoncombinationofMNP－H8＋QD－H8indetectionofPseudomonasaeruginosa表26种组合检测12种非结核分枝杆菌结果Tab.2Sixcombinationsondetectionof12kindsofnon－tuberculosismycobacteriaNote：“－”meansredfluorescencesignalcouldnotbeobservedinmicroscope；the“＋”meanstheredfluorescentsignalcouldbeobserved.H8－H8H8－MabH8－MabcPab－H8Pab－MabPab－MabcMTB＋＋＋＋＋－Mycobacteriumkansasii－－－－－－Mycobacteriumchelonae－－－－＋－Mycobacteriumfortuitum－＋－－＋－Mycobacteriumgordonae－－－－－－Mycobacteriumaurum－－－－－－Mycobacteriumneoaurum－－－－＋－Mycobacteriumgivum－－－＋＋－Mycobacteriumaichiense－＋－－－－Mycobacteriummicroti＋－－－＋－Mycobacteriumsmegmatis＋＋－－－－Mycobacteriumnonchromogenicum－＋－＋－－Mycobacteriumphlei－－－－－－2.3特异性检测6种组合检测12种NTM，显微镜下观察结果见表2,其中“+”代表显微镜下可见红色荧光，“－”代表观察不到红色荧光。6种组合检测荧光值测量结果如图3和图4,图3和图4均表明多肽H8的特异性高于抗体Mab和Mabe,图3和图4结起来表明，多肽H8的特异性高于抗体Pab。2.4下限检测组合MNP-H8+QD-H8和MNPPab+QD-H8检测下限均为102条菌/mL,在检测低浓度细菌（S106细菌/mL）时,MNP-H8+QD-H8组合检测效果较好，此时阳性荧光值与阴性对照的比值大于组合MNP-Pab+QD-H8检测的比值。荧光量子点QD-Mab和QD-Mabe与免疫磁珠MNPH8组合检测下限分别为105条菌/mL和106条菌/mL;QD-Mab与免疫磁珠MNP-Pab组合检测结果为阴性，荧光量子点QD-Mabe与免疫磁珠组合检测下限为105条菌/mL,6组组合下限检测结果如图5所示。3讨论纳米技术在MTB检测中研究相关报道甚少［10-11］,Liandris等［9］采用商业化抗体作为配体，修饰纳米磁珠和荧光量子点，通过检测MTB表面抗原达到分离检测MTB的目的，检测下限为102条菌/mL。他们的研究直接以商业化MTB抗体作为配体进行检测，并未对不同配体组合的检测效果进行评价。本研究对不同配体组合进行评估，以期获得高特异性高灵敏性的组合用于MTB检测。图3MNP-H8与3种功能化荧光量子点组合检测13种分枝杆菌1:堪萨斯分枝杆菌；2：龟-脓肿分枝杆菌；3：偶然分枝杆菌4：戈登分枝杆菌；5：金色分枝杆菌；6:新色分枝杆菌7:浅黄分枝杆菌；8:爱知分枝杆菌；9:田鼠分枝杆菌；10:耻垢分枝杆菌；11:不产色分枝杆菌；12:草分枝杆菌；13:H37RvFig.3ThirteenNTMweredetectedbyMNP-H8combinedwiththreefunctionedfluorescentdedequantumdots1:Mycobacteriumkansasii；2:Mycobacteriumchelonae；3:Mycobacteriumfortuitum；4:Mycobacteriumgordonae；5:Mycobacteriumaurum；6:Mycobacteriumneoaurum；7:Mycobacteriumgivum；8:Mycobacteriumaichiense；9:Mycobacteriummicroti；10:Mycobacteriumsmegmatis；11:Mycobacteriumnonchromogenicum；12:Mycobacteriumphlei；13:H37Rv图4MNP-Pab与3种QD组合检测13种分枝杆菌1:堪萨斯分枝杆菌；2:龟-脓肿分枝杆菌；3:偶然分枝杆菌4:戈登分枝杆菌；5:金色分枝杆菌；6:新色分枝杆菌7:浅黄分枝杆菌；8:爱知分枝杆菌；9:田鼠分枝杆菌；10:耻垢分枝杆菌；11:不产色分枝杆菌；12:草分枝杆菌；13:H37RvFig.4ThirteenNTMweredetectedbyMNP-PabcombinedwiththreeQDs1:Mycobacteriumkansasii；2：Mycobacteriumchelonae；3：Mycobacteriumfortuitum；4：Mycobacteriumgordonae；5：Mycobacteriumaurum；6：Mycobacteriumneoaurum；7：Mycobacteriumgivum；8：Mycobacteriumaichiense；9：Mycobacteriummicroti；10：Mycobacteriumsmegmatis；11：Mycobacteriumnonchromogenicum；12：Mycobacteriumphlei；13：H37Rv图56组组合检测MTB下限结果Fig.5ThelowlimitdetectiononsixcombinationsofdetectingMTB本研究主要采用了目前市售常用抗MTB多克隆抗体、单克隆抗体以及本室筛选获得的MTB菌体结合肽［7］和抗热休克蛋白65单克隆抗体进行组合，对免疫磁珠荧光量子点技术检测MTB的配体分子进行评估。结合肽H8是以H37RV灭活菌体为靶分子，应用噬菌体展示随机7肽文库进行筛选，并于第2~4轮的筛选中加入耻垢分枝杆菌进行反筛获得，与MTB具有较强的结合活性及一定的特异性。本研究中，多肽H8分别与纳米磁珠和荧光量子点偶联，多克隆抗体与捕获用纳米磁珠偶联，单克隆抗体则与检测用荧光量子点偶联，在检测，多抗作为包被抗体，单抗作为检测抗体［12－13］，获得2种免疫磁珠，3种功能化荧光量子点，共6种组合。6组组合检测MTB结果表明，组合MNP-Pab+QD-H8检测的阳阴比值最大（4.394）,组合MNP-H8+QD-H8组合稍次之（3.956）,均高于其它4组组合，荧光显微镜下也可见，组合MNP-Pab+QD-H8和MNP-H8+QD-H8检测荧光信号较强，显著高于其它4组组合，表明多肽H8偶联的功能化荧光量子点检测效果优于两种单克隆抗体（Mabe和Mab）偶联的功能化荧光量子点。MTB结合肽H8是以MTB灭活菌体为靶分子，耻垢分枝杆菌作为反筛分子利用噬菌体展示技术筛选获得,耻垢分枝杆菌是一种快生长分枝杆菌,细胞壁结构与以MTB为代表的慢生长分枝杆菌有区别，将与快生长分枝杆菌结合的噬菌体洗脱下来。并且经过4轮筛选，与MTB亲和性高的噬菌体克隆富集被洗脱下来，进一步鉴定可获得具有高特异性的MTB结合肽［6］。此外，多肽的量很容易控制，与荧光量子点偶联时的浓度较高，而使MTB结合肽H8与荧光量子点偶联的效率高于单抗偶联的效率，使得其在检测时亲和性较高。目前，尚无一种针对MTB高亲和性高特异性的分子，所以MTB细菌学检测灵敏度和特异性均不高［13］。本研究中，虽6种组合检测3种非分枝杆菌时，显微镜下均观察不到红色的荧光信号，测量荧光值很低甚至为负值，检测结果均为阴性，但是在特异性检测NTM时，不同组合之间检测结果还是存在明显差异。Mabe偶联的功能化荧光量子点与2种免疫磁珠组合，检测12种NTM结果均为阴性，表明Mabe的特异性很好，但是Mabe偶联的功能化荧光量子点与MNP-Pab组合检测MTB为阴性，与MNP-H8组合检测MTB为弱阳性，表明Mabe与MTB的亲和性不高，故不能作为免疫磁珠荧光量子点技术检测MTB的配体分子6种组合特异性检测结果表明，多肽H8和Mabe的特异性均高于单抗Mab，使得其在免疫磁珠荧光量子点技术检测MTB中应用受限。偶联H8和多抗Pab的两种免疫磁珠与3种功能化荧光量子点组合检测，表明多抗Pab的特异性和亲和性均高于H8，说明我们筛选获得的结合肽H8虽与MTB有较强的结合活性，但其特异度还需进一步提高［5］。由于上述原因，6组组合下限检测时，只有偶联多肽H8的功能化荧光量子点与2种免疫磁珠组合检测下限较高（均为102条菌/mL）,其余4组组合的检测下限均不是很高（约105~106条菌/mL）。综上所述，偶联MTB结合肽H8的功能化荧光量子点，与两种免疫磁珠组合检测下限和特异性均较高，两组组合均可作为免疫磁珠荧光量子点技术检测MTB的最优组合。本研究结果表明我们筛选获得的多肽比市售的单克隆抗体具有更高的亲和性和特异性，完全可以取代单抗，作为一种有效的MTB检测用配体分子。但MTB结合肽H8同时与荧光量子点和免疫磁珠偶联，可能会竞争同一结合位点，导致检测效果不佳；而利用MTB结合肽H8与多抗Pab协同作用，可以增加对MTB的捕获能力提高检测的灵敏度，所以组合MNP－Pab＋QDH8是最佳组合。在本研究的基础上，我们将进一步优化该检测技术，并用于更多不同类型标本的检测，详见后续报道。参考文献：BoWJ，HuZY，LiuZH，etal.PreparationonapatamersofIgGantibodiesfromTBpatientsanditsspecificityidentification[J].ChinJZoonoses，2011,27(12):31-35.(inChinese)柏文娟，胡忠义，刘忠华，等•结核患者血清IgG抗体适体的制备及特异性鉴定J].中国人兽共患病学报，2011，27(12):31-35.YangHS，HuZY，LiuZH，etal.Screeningoftuberculosisspecificantibodybindingpeptides[J].ChinJPreventMed，2011，45(1):12-16.(inChinese)杨焕森，胡忠义，刘忠华等，结核特异性抗体结合肽的筛选研究[J].中华预防医学杂志，2011,45(1):12-16.LeeWH，KimYG，ChungBG，etal.Nano／microfluidicsfordiagnosisofinfectiousdiseasesindevelopingcountries[J].AdvDrugDelivRev,2010,66:449-457.DOI:10.1016／j.addr.2009.11.016ThiruppathirajaC,KamatchiammalS,DaikkappanP,etal.SpecificdetectionofMycobacteriumsp.genomicDNAusingduallabeledgoldnanoparticlebasedelectrochemicalbiosensor[J].A-nalBiochem,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