卫生化学第三章 紫外-可见分光光度法

卫生化学1第三章

紫外—可见分光光度法第一节概述2光谱分析法是利用物质与光（辐射能）相互作用而建立起来的定性、定量和结构分析方法。按作用粒子可分为原子光谱法、分子光谱法和核磁共振波谱法；按吸收和发射光分为吸收光谱和发射光谱；按光的能量可分为射线光谱法、x射线光谱法、紫外可见光谱法、红外光谱法等。3紫外可见分光光度法（紫外可见吸收光谱法）是根据溶液中物质的分子或离子对紫外——可见光谱区的辐射能的吸收来研究物质的组成和结构的方法。该方法具有较高的灵敏度和准确度，检出限可达10-7

g/ml，相对误差通常为1%～5%。该方法仪器设备简单、操作方便、易于掌握和推广，是常用分析方法之一。4光是一种电磁波，整个电磁波包括：一、电磁辐射与电磁波谱无线电波微波红外光可见光紫外光X射线射线5这些电磁波都具有共同的特点：它们作为横向电磁波在空间传播，在真空中的传播速度等于光速，即6光具有波粒二象性，即波动性和粒子性。波动性：折射、衍射、偏振及干涉等性质。粒子性：具有动量，光电效应。光是由光子（或称光量子）所组成，光子具有能量（hv）和动量（hv/c）。7光子的能量与波长的关系为：能量J或eVPlanck常数6.626×10-34J·s频率，Hz光速2.998×108m/s波长nm1eV=1.602×10-19J式中，h和c都是常数，可见，光的能量与波长成反比。波长愈长，能量愈低；波长愈短，能量愈高。9例：计算波长为200nm的光子的能量解：10紫外——可见光区光子的能量和波长的关系见下表：（nm）200300400500600760E（eV）6.204.133.102.482.071.6311电磁波谱例：计算频率为100MHz的电磁波的波长12例：由铜产生的X射线的波长是0.154nm，其频率为：可见，电磁辐射的波长和频率范围（叫电磁波谱）是非常大的。13当一束白光通过一个三棱镜，我们可以看到白光是由许多颜色组成的，这种现象在rainbow中也可以看到。白光的波长大约从400nm～760nm，人的眼睛对这个区域的光是敏感的，因此称为可见光，可见光短波的一端是紫色，长波的一端是红色。14电磁波谱按能量不同可分为：无线电波1～1000m微波10-3～1m红外0.76～1000m可见400～760nm紫外10～400nm近紫外200～400nm远紫外10～200nmX射线0.01～10nm本章重点讨论15二、吸收光谱的产生吸收光谱又可分为原子吸收光谱和分子吸收光谱。1.原子吸收光谱原子吸收光谱是基于原子外层电子选择性地吸收某些特定波长的光发生跃迁而产生的。是线状光谱。原子轨道、量子化。原子光谱（原子吸收光谱、原子发射光谱、原子荧光光谱）是基于原子外层电子跃迁。2.分子吸收光谱分子吸收光谱是带状光谱，比较复杂，是由分子结构的复杂性引起的。分子内部有电子运动、原子之间的相对振动、分子转动三种运动形式，相应这三种不同的运动形式，分别对应分子中的三种能级，即：16当分子吸收能量后，就从基态能级跃迁到激发态能级。分子吸收能量也是量子化的，即只吸收对于两个能级差的能量：电子能级差在1～20eV（60～1250nm），主要在紫外—可见区，由此产生的吸收光谱称为紫外—可见光谱，又称电子光谱。在电子能级跃迁的同时，不可避免地伴随分子振动和转动能级的跃迁，使得分子光谱是带状光谱。17三、物质的颜色

当一束白光通过棱镜后就色散成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等颜色的光，它们具有不同的波长范围。18白光红650～750紫400～450蓝450～480绿蓝480～500绿500～560黄绿560～580黄580～600橙600～65019

反之，这些不同颜色的光按一定的强度比混合后便又形成白光。进一步的研究表明，只需将两种适当颜色的光按一定的强度比例混合即可形成白光，这两种光称为互补色光。阳光、白炽灯光等白光就是由一对对互补色光按一定强度比例混合而成的。20物质呈现的颜色吸收光颜色波长范围（nm）黄绿紫400～450黄蓝450～480橙红绿蓝480～500红紫绿500～560紫黄绿560～580蓝黄580～600绿蓝橙600～650蓝绿红650～750物质呈现的颜色与吸收光颜色的关系21物质对光的选择性吸收物质的分子内部具有一系列不连续的特征能级，包括电子、振动和转动能级，这些能级是量子化的。一般情况下，物质分子处在能量最低、最稳定的基态。当用光照射某物质后，如果光的能量恰好与物质分子的某一能级差相等，这一波长的光即可被分子吸收，从而使分子从基态跃迁到激发态。这就是说，并非任一波长的光都可以被某一物质所吸收。由于不同物质的分子组成和结构不同，它们所具有的特征能级也不同，能级差当然也不同。物质只能吸收与其分子内部能级差相等的光，所以物质对光的吸收具有选择性。22物质具有颜色，就是它对不同波长的可见光具有选择性吸收的结果。物质呈现颜色与它所吸收光的颜色（波长）有一定关系。例如，当白光通过CuSO4溶液时，由于水合Cu2+选择性地吸收了部分黄色光，使透射光中蓝色光未能完全互补，与是CuSO4溶液呈现蓝色。由于透射光中其它颜色的光仍然两两互补为白光，所以物质呈现的颜色恰好是它所吸收的光的互补色。又如KMnO4溶液呈紫红色，则说明它选择性地吸收了白光中的绿青色光。若物质对白光中所有颜色的光全部吸收，它就呈现黑色；若反射所有颜色的光则呈现白色；若透过所以颜色的光，则为无色。23KMnO4溶液选择性的吸收了525nm附近的绿青色光，而对与绿青色光互补的400nm附近的紫色光几乎不吸收，所以KMnO4溶液呈紫红色。24此外，溶液颜色的深浅，决定于溶液吸收光的量的多少，即取决于吸光物质浓度的高低。如CuSO4溶液的浓度愈高，对黄色光的吸收就愈多，表现为透过的蓝色光愈强，溶液的蓝色愈深。因此，可以通过比较溶液颜色的深浅来确定溶液中物质的含量。25（一）吸收曲线（吸收光谱）以上只是对物质所呈现的颜色进行了定性的描述，若要进行准确的定量描述，则需绘制该溶液的吸收曲线。即让不同波长的单色光依次照射溶液，四、紫外—可见光谱与分子结构的关系并测量在每一波长处对光的吸收程度的大小（吸光度），并以波长（）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标作图，即可得一条吸光度随波长变化的曲线，称为吸收曲线或吸收光谱，它能更准确地描述物质对各种不同波长光的吸收情况。26吸收峰谷肩峰末端吸收分子吸收光谱的形状取决于分子的内部结构，不同分子的内部结构不同，因此，分子吸收光谱是物质定性的依据。27能量成键成键未成键反键反键n**→*→*n→*n→*分子中外层电子能级及跃迁类型示意图（二）有机化合物的吸收光谱有机化合物的吸收光谱是由分子外层电子跃迁而产生的。有机分子的轨道类型及跃迁类型如图所示：28能量成键成键未成键反键反键n**→*→*n→*n→*1.→*跃迁键比较稳定，即电子从成键轨道跃迁到*反键轨道，所需的能量很大，此能量相当于真空紫外区的辐射能。饱和烃只能发生→*跃迁，因而吸收光谱都在真空紫外区。如甲烷的最大吸收波长在125nm，乙烷在135nm。29能量成键成键未成键反键反键n**→*→*n→*n→*2.→*跃迁不饱和有机化合物分子中、成键轨道和*、*反键轨道。存在→*跃迁和→*跃迁。→*跃迁所需的能量较→*跃迁所需能量小。任何具有不饱和键的有机化合物均可发生→*跃迁，但单个饱和键的吸收波长也在200nm以下。如乙烯的吸收峰在165nm。30能量成键成键未成键反键反键n**→*→*n→*n→*3.n→*跃迁若形成不饱和键的原子含有杂原子（N、S、P、O），则可发生n→*跃迁n→*跃迁所需的能量较→*跃迁所需的能量更小。吸收波长更长，但由于属跃迁禁阻类型，吸收强度很小。如丙酮除有→*跃迁外，还有n→*跃迁，吸收波长在280nm左右。31能量成键成键未成键反键反键n**→*→*n→*n→*4.n→*跃迁在含有杂原子（N、S、P、O）的饱和有机化合物分子中可发生n→*跃迁n→*跃迁所需的能量较→*跃迁所需的能量接近。如甲醇除有→*跃迁外，还有n→*跃迁，吸收波长在183nm左右32综上所述，各种电子由基态跃迁到激发态所需的能量不同，次序为n→*和→*跃迁所需能量较大，一般在远紫外区。有机化合物的UV—Vis光谱主要以

n→*和→*跃迁为基础，这两类跃迁都要求化合物中含有不饱和官能团以提供键，因此，把含有键的不饱和基团称为生色团。双键的n→*和→*跃迁所需的能量在200nm左右。如果有共轭双键存在，因形成大键，使→*跃迁所需的能量降低，导致最大的吸收峰向长波方向移动，称为红移。共轭链愈长，红移现象愈显著，甚至到可见光区，呈现颜色。33化合物H(CH=CH)nH溶剂max/nmn=1己烯蒸汽162n=21,3-丁二烯正己烷217n=31,3,5-己三烯正己烷258n=41,3,5,7-辛四烯环己烷304n=51,3,5,7,9-癸五烯正辛烷334n=11-胡萝卜素正己烷480共轭作用对烯烃最大吸收的影响34醛、酮和羧酸中C=O双键同C=C双键的共轭作用也会降低*的的能量，从而使n→*和→*跃迁的吸收峰都发生红移。如巴豆醛CH3CH=CHCH=O乙醇溶液的吸收光谱在220nm处有一个由→*跃迁产生的吸收峰和在322nm处有一个由n→*跃迁产生的吸收峰。单独烯键的→*跃迁吸收峰在170nm附近，单独羰基的→*跃迁吸收峰在166nm，n→*跃迁吸收峰在280nm。芳香化合物的紫外光谱具有→*跃迁产生的三个特征吸收带。如，苯在184nm处有一强吸收带，在204nm处有一强吸收带，在254nm处有一弱吸收带（B带），B吸收带是由→*跃迁和苯环的振动能级跃迁叠加而产生，具有很好的精细结构，常用于芳香化合物的辨认。苯的这三个特征吸收带受苯环上取代基的影响会发生移动。35化合物溶剂max苯2%甲醇254甲苯2%甲醇262氯苯2%甲醇264碘苯2%甲醇258苯酚2%甲醇271酚盐离子2%甲醇286苯甲酸2%甲醇272苯胺2%甲醇280苯胺盐离子2%甲醇254某些苯衍生物的吸收特性36当苯环上有—OH、—NH2等取代基时，吸收峰红移，吸收强度增大。原因是这些基团的n电子能同苯环上的π电子发生共轭作用，使*轨道能量降低。像这样一些本身在紫外和可见区无吸收，但能使生色团吸收峰红移，吸收强度增大的基团称为助色团。主要的助色团有羟基、氨基、烷氧基。需要注意的是，溶剂的极性对最大吸收波长影响较大，在描述某化合物的吸收情况时应注明溶剂。一般来说，随着溶剂极性的增大，→*吸收峰发生红移，n→*跃迁吸收峰发生蓝移（或紫移）。37（三）无机化合物的吸收光谱1.d—d跃迁和f－f

跃迁过渡金属离子未充满的d轨道，由于受配位场（或晶体场）的影响而发生分裂，当吸收光时可发生d—d跃迁，吸收波长取决于分裂能的大小，L越强，分裂能越大，吸收波长越短。H2O的配位场小于NH3特点：吸收强度小。382.电荷迁移跃迁在金属配合物中，配体和金属之间发生跃迁，一般是L→M，吸收波长取决于L给电子和M接受电子能力。SCN-比Cl-易给电子，FeSCN2+，吸收波长长，在可见区，FeCl2+在紫外区。特点：灵敏度高，实际工作中常用。常将M与某L（显色剂）生成具有电荷迁移的配合物，然后进行含量测定。3.－*跃迁配体具有双键的金属络合物39第二节光的吸收定律一、郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律1.透光度和吸光度当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被容器表面反射。40设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则41在分光光度分析中，通常将待测溶液和参比溶液分别置于同样材料和厚度的容器中，让强度为I0的单色光分别通过两个容器，再测量透射光强度。这样，反射光的强度基本相同，其影响可以互相抵消，则当一束单色光通过溶液后，由于吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。当光透过浓度为c，液层厚度为b的溶液时，由于一部分光被吸收，因此随着溶液浓度和液层厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射光的强度减小。透射光强度与入射光强度之比称为透光度（transmittance），用T表示：42

例如，入射光的强度为100，透射光的强度为35，则T=0.35或35%。

溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收程度愈小；相反，透光率愈小，对光的吸收程度愈大。实践证明，溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关。如果保持入射光不变，则溶液对光的吸收程度只与溶液浓度和液层厚度有关，即43为了方便起见：吸光度（absorbance）吸光系数液层厚度溶液浓度44当a、c一定时，A∝bLambert’slaw当a、b一定时，A∝cBeer’slawLambert-Beer定律可表述为：在一定条件下，物质的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比，称为光吸收定律，是吸收光谱定量的依据。Lambert-Beer定律是均匀、非散射介质对光吸收的基本定律，只有对入射光是单色光才完全适用。452.吸收系数absorptivitya为吸收系数，是指在一定入射光波长下，单位浓度及单位液层厚度时的吸光度。即一般b的单位为cm，a的单位与c的单位有关。46比吸光系数specificabsorptivity比吸光系数是指一定波长时，溶液浓度为1%（w/V），厚度为1cm的吸光度，用表示。47摩尔吸光系数molarabsorptivity摩尔吸光系数是指一定波长时，溶液浓度c为1mol/L，液层厚度b为1cm时的吸光度，用表示。和不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测吸光度计算得到。48解：例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)，配成25.00ml水溶液，吸收池厚度为0.5cm，在361nm波长下测得吸光度为0.414，计算摩尔吸光系数。49例：用纯氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278nm，用1.00cm的吸收池，测得T=24.3%，求比吸光系数和摩尔吸光系数。50与物质的本性、溶剂和入射光的波长有关，即（1）物质不同，不同，是物质的特性常数。（2）溶剂不同，同一物质的不同，所以应注明溶剂。（3）不同，同一物质的吸收系数也不同，所以吸收系数应注明波长；（4）入射光的纯度：单色光是经单色器色散成波长范围很窄的光。实际上，不管单色器的分辨率有多高，所谓的单色光仍然是有一定的宽度的。例如高锰酸钾溶液的吸收曲线。51如果在AB范围内，～1700，CD范围内～2300，EF范围～2500。因此，还应考虑单色光的纯度，即使用仪器的精确度（光强和色散元件的分辨率。52第三节紫外—可见分光光度计紫外—可见分光光度计的类型很多，但其原理基本相似。一般由五部分构成，即光源、单色器、吸收池、检测器、指示器（信号显示装置）53一、分光光度计的主要部件1.光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。钨及碘钨灯：340～2500nm，多用在可见光区；氢灯和氘灯：160～375nm，多用在紫外区。542.单色器单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。棱镜是利用不同波长的光具有不同的折射率而使复合光分开的。用玻璃和石英制成。光栅grating利用光的衍射和干涉作用使复合光分开。其特点是：色散波长范围宽，可用于紫外、可见、红外等光谱区，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变，即均匀色散（色散近于线性）。现代仪器多用光栅作色散元件。55狭缝狭缝是单色器的组成部分，对单色光的纯度起着非常重要的作用。狭缝有两种表示方法（1）用狭缝的实际宽度表示，以mm为单位，一般为0～2mm，（2）用通过出射狭缝的谱带宽度表示，以nm为单位，如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狭缝愈窄，光的单色性愈好，测得的吸收峰愈尖锐，但光强度减弱，测定灵敏度降低。56转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同波长单色光，从出射狭缝射出。573.吸收池absorptioncell比色皿cuvette盛放样品溶液的容器，用玻璃或石英制成，两透光面互相平行，具有精确的光程。紫外区用石英、可见区用玻璃。盛放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应匹配，即有相同的厚度与透光性。吸收池的光学面应垂直于光束方向。58使用时，应进行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，当被测物的量一定时，V越小（c越大），b越大，则A越大。改进吸收池的形状，使每单位光程所占的溶液体积尽可能小，即光程/体积比尽可能大。常规吸收池1cm，5ml微型吸收池，光程/体积比大于0.2的为微型吸收池（microcell）b=4cm，V=2，4/2=2594.检测器将光信号转变为电信号进行检测。光电管利用光电效应的原理。光电流通过负载电阻R，将电流变成电压信号，经放大器放大后，输给记录仪。60暗电流电极的热电子发射而产生的电流。暗电流愈小愈好。在分光光度计中，都设有补偿电路，消除暗电流。

光电管有两种：蓝敏光电管，为铯阴极，适用波长200～625；红敏管，银氧化铯，适用波长625～100061光电倍增管62光二极管阵列检测器photo-diodearraydetector光电二极管阵列检测器是在晶体硅上紧密排列一系列光二极管，如HP8452A型，在190～820nm，由316个二极管，当光透过晶体硅时，二极管输出的电讯号强度与光强度成正比。每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝，两个二极管中心距离的波长范围，称为采样间隔，二极管愈多，分辨率愈高，每个二极管可在1/10s，每隔2nm测一次，同时并行采集数据，在1/10s时间内，可获全光谱。63电荷偶合阵列检测器charge-coupleddevicearraydetector，CCD5.信号处理与显示装置光电管输出的信号很弱，经过放大后才能以某种方式将测量结果显示出来。信号处理包括一些数学运算。显示器可由电表、数字显示、荧光屏显示、结果打印、曲线扫描等。显示方式有T、A，有的还可以转换成浓度，ε等。64二、紫外可见光度计仪器分光光度计分为单波长和双波长仪器。1.单波长分光光度计单光束双光束（空间分隔）双光束（时间分隔）特点：因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。6566光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.双波长分光度计672.双波长分光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。SB1和SB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。68第四节分析条件的选择一、显色反应条件的选择

在可见光区进行测定,如果待测物本身有色，可直接进行测定；如果待测物无色或颜色较浅，则通过显色反应使待测物成为在可见区有吸收的物质。

能与无色物质反应生成有色物质的试剂称为显色剂，生成有色物质的反应称为显色反应，即待测组分显色剂有色化合物显色反应

常见的显色反应有配位(应用多)、氧还、重氮—偶联反应等。70

（一）对显色反应的要求

1.反应物的组成恒定，有确定的化学计量关系。

2.生成的有色物应具有一定的稳定性，在测量过程中吸光物质的吸光度无变化。

3.生成的有色物应具有较大的，即具有较高的灵敏度。

4.有色化合物和显色剂颜色差别明显，使显色测定时试剂空白小。

5.选择性好，干扰小或干扰易消除。为了满足以上要求，必须控制反应条件。

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（二）显色反应条件的选择

显色反应能否满足上述要求，除选择合适的显色剂外，控制显色反应条件也是非常重要的。因此，必须了解影响显色反应平衡及反应速度的各种因素，并进行严格控制，才能保证分析结果的准确可靠。721.显色剂的用量

通常显色反应是可逆的，为了使待测组分完全定量地转变为吸光物质，显色剂必须过量。过量的显色剂可使反应完全。但显色剂用量过大，可能改变吸光物质的组成，或有其它副反应，同时，会增加空白值。所以，显色剂的用量应遵守过量、适量、定量。73

最适宜的显色剂用量是通过实验确定的，即固定其它条件，改变显色剂的用量，测吸光度，用A对显色剂用量作图，确定显色剂的最适宜的用量(吸光度值较大且已恒定）。74

2.溶液的pH值

溶液的酸度直接影响显色剂的颜色、浓度、显色反应和生成物的颜色等。

(1)对显色反应的影响不少有机显色剂是有机弱酸或弱碱，溶液pH变化，显色剂的存在型体会发生变化，从而影响显色反应的完全程度。

HRR-+H+

M+MR+75磺基水杨酸（SS）与Fe3+的络合物pH=1.8～2.5pH=4～8pH=8～11.5pH＞12紫红橙红黄色FeSS+

有些情况下也会改变配合物的组成，造成配合物颜色改变，使吸收峰变化。如：76

（2）对显色剂的颜色的影响一些显色剂具有酸碱指示剂的性质，在不同pH值溶液里显示不同颜色。如：PARpH＜6pH=7～10pH＞13黄橙红红H2RHR-R2-

要选择合适的酸度，使显色剂颜色不干扰测定。可选pH＜6，PAR与金属离子形成配合物的颜色为橙红色，本身为黄色，在测定波长下显色剂干扰小。77

（3）对金属离子存在状态的影响

pH值较高时，多数金属离子水解，生成氢氧化物沉淀。使金属离子浓度降低。

显色反应的最适宜酸度，应通过实验确定。方法是：固定溶液中待测物、显色剂的浓度，只改变酸度，测吸光度，以A对pH作图，找出适宜的酸度范围，如范围较窄，则选用缓冲溶液。注意参比也要调pH值。79

3.显色温度显色反应一般在室温下进行，但有些反应速度较慢，需在加热条件下才能迅速完成。对需要加热才能完成的显色反应，应通过实验确定适宜的显色反应温度。需要注意的是：待测溶液与标准溶液的温度要尽量一致，有时要用恒温水浴控温。804.显色时间

有的显色反应瞬间即可完成，即显色后即可测定；有的显色反应进行较慢，需经过一定时间才能完全生成吸光物质；有些情况下，吸光度达到一定值后又会慢慢降低。实际工作中，也应通过测定样品溶液在某波长下的吸光度随时间变化曲线，确定显色反应的最佳时间。8182

5.干扰物的影响及消除方法（1）干扰物本身有色或与显色剂形成有色化合物，有吸收；（2）在显色条件下，干扰物沉淀；（3）与待测离子生成更稳定的化合物。83

消除方法：（1）加入隐蔽剂掩蔽和干扰离子形成无色稳定配合物。（2）加入氧化剂或还原剂改变干扰离子价态。（3）选择适宜的显色条件如：控制酸度，使干扰离子不与显色剂作用。（4）通过选择测定波长，避开干扰。（5）分离干扰离子通过萃取、沉淀等方法分离干扰离子

。84二、测定条件的选择

测定条件包括测定波长、狭缝宽度、吸光度读数范围和参比溶液。

（一）测定波长的选择

一般选择最大吸收波长作为测定波长，此处吸光度最大，灵敏度最高，且在此波长附近，吸光度随波长变化最小，测定精密度高。85525545但若最大吸收波长出有干扰，应避开。波长的选择原则：“吸收大，干扰小”。86

（二）吸光度读数范围的选择

A0.2～0.8

光度误差（photometricerror）——在不同的吸光度范围内读数，可引入不同程度的误差，这种误差通常以单位百分透光度引起的浓度相对误差来表示，称为光度误差。由光吸收定律可导出：87

由公式可知，测定结果的相对误差与透光度及T有关，T为仪器测得透光度T的随机误差，在仪器一定时，可基本看作常数，这时，测定结果的相对误差与透光度读数之间的关系如图：

由图可见，吸光度太大或太小，测定结果的相对误差都较大。透光度在65%～15%，即吸光度约在0.2～0.8范围内，测定结果的相对误差较小。当透光度为36.8%，及吸光度为0.434，测定结果的相对误差最小,为2.7（%）。（%）89

因此，为了减小测量误差，通常通过控制溶液浓度或选择比色皿的规格，将吸光度控制在0.2～0.8范围内。

当＜0.2时，选厚度大的吸收池；或进行浓缩，或增大取样量。当A＞0.8时，可采用稀释溶液，或采用较薄的吸收池。

（三）空白（参比）溶液的选择：

在用分光光度计测定吸光度时，常使用参比溶液（referencesolution）或称空白溶液（blanksolution）。其作用是调节吸光度零点、抵消溶液中其它组分、吸收池和溶剂对光的吸收，抵消试剂（包括显色剂）或样品基体所引起的干扰。91续前

正确选用空白溶液，对提高分析的准确度非常重要。常用的参比有：92

（1）溶剂空白:

当溶液中只有待测组分有吸收，试剂（包括显色剂）和样品中的其它成分均无吸收时，可用溶剂作空白溶液，简称溶剂空白。例如，测Mn2+时，用HIO4氧化Mn2+成MnO4-，试剂和样品溶液均无色，可用蒸馏水作空白溶液。93

（2）试剂空白：显色剂或其它试剂有吸收，按显色反应相同的条件，不加样品，同样加入各种试剂和溶剂作为空白溶液，称为试剂空白。如：双硫腙测铅。94

（3）样品空白：样品基体有色，显色剂与样品基体不显色。按显色反应相同的条件，取同样量的样品溶液，不加显色剂，作为空白溶液，称为样品空白。这种空白适用于样品溶液中有吸收干扰的共存组分，且显色剂无吸收的情况。如用硫氰酸盐测钼时，用不加硫氰酸盐的样品溶液作空白，可消除共存Cr3+、Ni3+、Cu2+等有色离子的干扰。95

（4）平行操作空白：用不含待测组分的样品，在相同条件下，与待测样品同时进行处理，此称为平行操作空白。这种空白常被当作一个样品溶液来处理，所测得值称为空白值。最后结果应从样品测得值中减去此空白值。可消除分析过程中引入的干扰物质。如：用4-氨基比林比色法测废水中酚。水样空白、标准系列均在相同条件下与水样同时进行处理。加同样的各种试剂，用氯仿进行液液萃取，然后用分光光度计进行比色测定。96第五节分光光度法的定性和定量分析吸收曲线、max和max，不同的化合物可能有相同的max，但不可能max和max完全相同，测max，通常配高、中、低三种浓度，在max处测A，计算max，求平均值。

定性鉴别的依据→吸收光谱的特征吸收光谱的形状吸收峰的数目吸收峰的位置（波长）吸收峰的强度相应的吸光系数上述各项特征均相同，可能为同一种物质。光谱定性，有一定的局限性，主要是分辨率不