光谱分析技术hu

光谱分析技术hu第1页，共118页，2023年，2月20日，星期三光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量“H”所构成。λ＝C/νλ——波长C——光速ν——频率，单位时间通过一个定点的波数。第2页，共118页，2023年，2月20日，星期三紫外可见吸收光谱的形成

按照量子力学原理，分子能态按一定的规律跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和两个能级间的能量差要符合下列关系：E＝E2-E1＝h第3页，共118页，2023年，2月20日，星期三E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大，E＝0.05～1.0ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大，E＝1～20ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、紫外或波长更短的光谱区。第4页，共118页，2023年，2月20日，星期三可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为反键轨道）。第5页，共118页，2023年，2月20日，星期三若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度“A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。第6页，共118页，2023年，2月20日，星期三第7页，共118页，2023年，2月20日，星期三⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最大吸收波长，以λmax表示。⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin表示。⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。第8页，共118页，2023年，2月20日，星期三λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中，λmax、λmin、­肩峰以及整个吸收光谱的形状决定于物质的性质，其特征随物质的结构而异，所以是物质定性的依据。测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意测定的条件，如溶剂、浓度等。第9页，共118页，2023年，2月20日，星期三常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到七十年代末为止已收集28585个化合物紫外光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光谱图2000多幅。第10页，共118页，2023年，2月20日，星期三由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。第11页，共118页，2023年，2月20日，星期三常用的术语紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色效应。发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π*、n→σ*等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝O等发色团。助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团相连接，产生n→π*跃迁，使吸收波长向短波移动，称为兰移（或深色效应）。第12页，共118页，2023年，2月20日，星期三增色效应（hyperchromiceffect）:核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加，即ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用的改变所致，通常在260nm处测量。减色效应（hypochromiceffect）:在一定的条件下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。第13页，共118页，2023年，2月20日，星期三有色溶液对可见光线有选择性的吸收作用，有些无色溶液，所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计。分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广。第14页，共118页，2023年，2月20日，星期三第二章光谱分析技术第一节朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律第二节分光光度计基本结构第三节光度法的误差第四节分光光度法的应用第五节原子吸收分光光度法第六节荧光分析法第七节散射光谱分析法第15页，共118页，2023年，2月20日，星期三第一节朗伯-比尔（Lambert-beer）1.1朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律：A：吸光度，又称光密度“OD”T：透光度，T＝I/I0I0：照射到吸收池上的光强It：透过吸收池的光强。第16页，共118页，2023年，2月20日，星期三1.2吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：A=εbCε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，L·mol-1·cm-1b：样品光程（cm），通常使用1.0cm的吸收地。C：样品浓度，mol·L-1摩尔吸光系数ε是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，说明电子跃迁的几率大，通常ε＝10～105：一般认为ε＞104为强吸收；ε＝103～104

为较强吸收；ε＜102

为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。第17页，共118页，2023年，2月20日，星期三1.3应用朗伯-比耳定律的条件：入射光波长应为λmax，且单色性好；被测溶液具有均匀性、非散射性(不浑浊，也不呈胶体)；被测物质的浓度应在一定范围内；朗伯-比耳定律不仅适用于可见光，也适用于红外光和紫外光；朗伯-比耳定律不仅适用于均匀非散射的液体，也适用于固体和气体。因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。第18页，共118页，2023年，2月20日，星期三第二节分光光度计基本结构2.1常见的分光光度计类型2.2分光光度计基本结构

2.2.1电光源系统

2.2.2样品室

2.2.3单色器第19页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.1常见的分光光度计类型2.1.1单光束分光光度计2.1.2双光束分光光度计2.1.3双波长分光光度计2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计第20页，共118页，2023年，2月20日，星期三第21页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.1.1单光束分光光度计早期的分光光度计都是单光束的，例如751型、75lG型，有些仍为手动操作，即固定在某一波长，分别测量比较样品、空白或参比液的透光率或吸光度，操作比较费时，要求光源和检测器的供电电压稳定性高，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但其光路简单，能量损失小，适用于物质的定量分析。第22页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.1.2双光束分光光度计双光束分光光度计是目前发展最快，应用最为普遍的一种。既可直接读数，又可扫描图谱。因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和样品溶液，所以可以减小因光源强度不稳带来的误差。双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收池，可在随意改变波长的同时记录吸光度。其操作简单，测量快速，自动化程度高。测定含量时，为准确起见，仍宜用固定波长测量方式。第23页，共118页，2023年，2月20日，星期三第24页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.1.3双波长分光光度计双波长分光光度计是将光源发出的光分成两束，分别进人各自的单色器，获得两束波长可任意调节的单色光，然后交替照射到同一个吸收池，到达同一检测器，测得在两个波长处的吸光度差值△A，△A与被测组分的量成正比。此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带来的误差，主要用于存在干扰组分的样品、浑浊样品和多组分混合样品的测定。但仪器价格昂贵，体积较大。第25页，共118页，2023年，2月20日，星期三第26页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.1.4光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检测分光光度计是一种具有全新光路系统的仪器。具有光谱响应宽、数字化扫描准确、性能比较稳定等优点。由于全部波长同时被检测，而且光二极管的响应很快，一般可在0.1s的极短时间内获得190～820nm范围的全光光谱，可作为追踪化学反应和反应动力学研究的重要工具。第27页，共118页，2023年，2月20日，星期三随着仪器的改进和计算机的应用，又出现了许多新的测量技术，如1～4阶导数光谱测量技术、三波长分光光度法、速率分析或动力学分析等。第28页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.2分光光度计基本结构光源单色器吸收池检测器显示系统2.2.1电光源系统2.2.2样品室2.2.3单色器第29页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.2.1电光源系统可见光源：钨/卤钨灯(320-2500nm)，卤钨灯更好。紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯(160-375nm)，氘灯产生的光谱强度比氢灯大3～5倍，而且寿命也比氢灯长。

红外光源：碘钨灯(近红外)、能斯持灯(中红外)、汞灯(远红外)。线光源：空心阴极灯/金属(汞/钠)蒸汽灯激光光源：固体/气体/染料激光器荧光分光光度计多用球形氙灯原子吸收光谱仪多用原子光谱灯，要求辐射的原子光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。第30页，共118页，2023年，2月20日，星期三能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成的长约2cm、直径约1mm的实心或空心棒组成，工作温度可达1300～1700℃，其发射的波长范围约为1～30μm，它的寿命较长、稳定性好。对短波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作不如硅碳棒方便。硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度达1200～1500℃。对于长波，其辐射效率高于能斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面大，操作方便、廉价。第31页，共118页，2023年，2月20日，星期三岛津荧光分光光度计RF-5301PC荧光分光光度计在越来越多的领域发挥着巨大的作用，比如生命科学中的定性定量分析，化学中的光化学反应的研究，食品中的残留农药检测和环境中大气、水质、土壤的污染评估。相比于吸光度法，荧光法的灵敏度更高，选择性也更好，把激发光、荧光波长相结合，可以测定混合物。RF-5301PC作为新一代的荧光分光光度计具有高水平的性价比和功能强大的软件，从日常分析到科学研究都发挥了极大的作用第32页，共118页，2023年，2月20日，星期三原子吸收光谱仪的光源主要采用空心阴极灯。空心阴极灯的结构如左图所示。1－紫外玻璃窗口；2－石英窗口，3－密封4－玻璃套，5－云母屏蔽；6－阳极；7－阴极；8－支架；9－管座，10－连接管脚第33页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.2.2样品室紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计的样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英比色皿。可见光范围用玻璃比色皿。紫外光范围用石英比色皿。原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常用的原子化器有火焰和石墨炉。第34页，共118页，2023年，2月20日，星期三2.2.3单色器凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单色光，并能通过出射狭缝分离出某一波长单色光的仪器，称为单色器。分光光度计中所用的单色器有两种类型：棱镜单色器和光栅单色器。第35页，共118页，2023年，2月20日，星期三单色器主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散元件、准直镜以及附属机械装置所组成。入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波长的光从狭缝中透出，而将其他波长的光挡住，不许其通过。第36页，共118页，2023年，2月20日，星期三1、棱镜单色器30゜利特罗（Litrow）式（自准式）60゜棱镜利特罗（Litrow）式瓦兹渥斯（Wadsworch）式泽尼特（Czerny-Turner）式第37页，共118页，2023年，2月20日，星期三光从一种介质射到另一种介质时，一部分光从界面反射回去称为反射，另一部分光则改变前进方向进入第二种介质称为折射。若入射角为i、折射角为θ，则其折射率n为：n=sini/sinθ。不同的光学材料具有不同的折射率，即便是同一种光学材料以相同的入射角照射，若波长不同，得到的折射角也不一样。第38页，共118页，2023年，2月20日，星期三第39页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、光栅单色器光路图光栅色散均匀、谱线清晰、工作波段宽，是棱镜无法比拟的。再加上它所组成的单色器的结构比较简单，所以近年来逐步取代了棱镜，而成为色散元件的主角。第40页，共118页，2023年，2月20日，星期三光栅原是指大量等宽、等间距的平行狭缝所组成的光学元件，是一种多狭缝部件，光栅光谱的产生是多狭缝干涉和单狭缝衍射两者联合作用的结果。多缝干涉决定光谱线出现的位置，单狭缝衍射决定谱线的强度分布。光栅分为平面透射光栅和反射光栅，反射光栅应用更广泛。反射光栅又可分为平面反射光栅（或称闪耀光栅）和凹面反射光栅。第41页，共118页，2023年，2月20日，星期三b为狭缝宽度d为光栅常数，它等于狭缝宽度加两狭缝之间的距离，即相邻两刻痕间的距离。θ为衍射角。i为入射角光栅的色散原理图光栅会聚透镜透镜焦平面上的受光屏平面透射光栅第42页，共118页，2023年，2月20日，星期三当光以垂直方向照射光栅即i＝0°，则

n=0，±1，±2，……，

n称为干涉的级。可以得到称为零级、一级、二级、……的光栅光谱。若入射光不是垂直地照射在光栅上，而是有一定的角度，则上式写为：

该式称为平面衍射光栅方程，简称光栅方程。第43页，共118页，2023年，2月20日，星期三反射型复制光栅，它是在平面玻璃上粘结上一定角度刻槽的铝反射膜而制成的。铝膜很薄(约0.1～1.5um)、很亮，故从外表看不出和一般的反射镜有什么明显的差异。第44页，共118页，2023年，2月20日，星期三光栅表面的铝膜质地很松软，极易擦伤，所以在维护时，严禁用任何擦拭物擦拭，更不能用手去触摸，否则会造成永久性损坏。万一光栅上落上了灰尘，只能用吹气球吹去。不同波长的光具有不同的衍射角，两者成比例关系。波长长者衍射角大，波长短者衍射角小。因此，利用光栅可以把不同波长的光分开，这就是光栅的色散原理。第45页，共118页，2023年，2月20日，星期三闪耀光栅光栅的宽度越大，总刻线数越多，分辨率越大。对同一线光谱而言，光栅的分辨率是常数，不随波长而变化。i是入射角，θ是衍射角，β是光栅刻痕角。反射面与光栅平面的夹角，称为闪耀角。第46页，共118页，2023年，2月20日，星期三3、滤光片在简易的比色计中，使用滤光片能够获得有限波长范围的光。滤光片分为吸收滤光片和干涉滤光片两种。吸收滤光片由有色玻璃或内夹在两玻璃片之间的有色染料的明胶所组成，这种滤光片适用于可见光区。干涉滤光片是根据光的干涉原理设计的，它是由透明的电解质（如氟化钙或氟化镁），夹在两块内侧涂有一层半透明金属（如银）簿膜的玻璃或石英片之间所组成。电解质的厚度必须严格控制。这种滤光片适用于紫外光区。第47页，共118页，2023年，2月20日，星期三偏离Beer定律的因素根据Beer定律，当波长和入射光强度一定时，吸光度A与吸光物质的浓度C成正比。不同浓度的标准溶液的吸光度，C与A之间的关系应该是一条通过原点的直线。但实际工作中常常会出现偏离直线的情况，即偏离Beer定律的现象。导致偏离的主要因素有化学因素与光学因素。第三节光度法的误差第48页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.1化学因素通常只有当溶液浓度小于0.01mol／L的稀溶液时Beer定律才能成立。随着溶液浓度的改变，溶液中吸光物质可因浓度的改变而发生离解、缔合、溶剂化以及配合物组成等的变化，使吸光物质存在形式发生变化，从而使吸光物质对光吸收的选择性和吸光强度也发生相应的变化。第49页，共118页，2023年，2月20日，星期三

随着浓度的增大，660nm处吸收峰减弱，而610nm处吸收峰增强，吸收光谱形状改变。由于离子浓度的变化，使吸光度与浓度成正比的关系发生偏离。例1：亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱第50页，共118页，2023年，2月20日，星期三例2：重铬酸钾的水溶液有以下平衡：若溶液稀释2倍，由于受稀释平衡向右移动的影响，Cr2O72-离子浓度不是减小2倍，Cr2O72-

离子浓度的减少明显地多于2倍。第51页，共118页，2023年，2月20日，星期三Cr2O72-、CrO42-两种离子在某一波长处吸光强度相差较大，致使重铬酸钾水溶液吸光度的降低与浓度的降低不成正比而偏离Beer定律。若控制溶液的酸度，在强酸性条件下测定Cr2O72-

，或在强碱条件下测定Cr2O72-

，偏离Beer定律的现象可以避免。第52页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.2光学因素3.2.1非单色光Beer定律只适用于单色光，而实际用于测量的是一定波长范围的复合光，由于吸光物质对不同波长的光的吸收能力不同，就导致了对Beer定律的偏离。第53页，共118页，2023年，2月20日，星期三例如，右图所示的吸收光谱，用谱带I所对应的波长进行分析，造成的偏离就比较小。用谱带Ⅱ所对应的波长进行分析就会造成较大的偏离。通常选择吸光物质的最大吸收波长作为测定波长。这样不仅能保证测定有较高的灵敏度，而且此处曲线较为平坦，吸光系数变化不大，对Beer定律的偏离程度就比较小。在保证一定光强的前提下，应使用尽可能窄的带宽宽度，同时应尽量避免采用尖锐的吸收峰进行定量分析。第54页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.2.2杂散光从单色光器得到的单色光中，还有一些不在谱带范围内的与所需波长相隔甚远的光，称为杂散光(straylight)。主要由仪器光学系统的缺陷或光学元件受灰尘、霉蚀的影响而引起。特别是在透光率很弱的情况下，杂散光的影响尤为显著。第55页，共118页，2023年，2月20日，星期三杂散光Is常随入射光强度I0的增大而增大。若供试品不吸收杂散光，(Is+I0)／(It+Is)<I0/It，A变小，为负偏离，供试品吸收杂散光，A增大，为正偏离。前一种情况在分析中常会遇到。

设照射光强度为I0，透过光强度为It，杂散光强度为Is，则观察到的吸光度为：第56页，共118页，2023年，2月20日，星期三随着仪器制造工艺的提高，绝大部分波长内杂散光的影响可忽略不计。但在接近紫外末端处，因在短波长光源强度和检测器灵敏度均减弱，杂散光的比例相对增大，测定时可能会出现假峰。如用钨灯作为光源时，350-400nm波长杂散光影响显著；若用紫外光源时，220nm以下的杂散光迅速增大。第57页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.2.3散射光和反射光吸光质点对入射光有散射作用，吸收池内外界面之间入射光通过时又有反射作用。散射光和反射光均由入射光谱带宽度内的光产生，对透射光强度有直接影响。散射和反射作用致使透射光强度减弱。真溶液散射作用较弱，可用空白进行补偿。混浊溶液散射作用较强，一般不易制备相同的空白溶液，常使测得的吸光度偏离，分析中不容忽视。第58页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.2.4非平行光通过吸收池的光，一般都不是真正的平行光，倾斜光通过吸收池的实际光程将比垂直照射的平行光的光程长。使厚度增大而影响测量值。这种测量时实际厚度的变异也是同一物质用不同仪器测定吸光系数时，产生差异的主要原因之一。第59页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3干扰的产生及其消除干扰物质的影响有以下几种情况：干扰物质本身有颜色或无色但与显色剂形成有色化合物，在测定条件下也有吸收；在显色条件下，干扰物质水解，析出沉淀使溶液混浊，致使吸光度的测定无法进行；与待测离子或显色剂形成更稳定的配合物，使显色反应不能进行完全。第60页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.1控制酸度根据配合物的稳定性不同，可以利用控制酸度的方法提高反应的选择性，保证主反应进行完全。例如，双硫腺能与Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+、等十多种金属离子形成有色配合物，其中与Hg2+生成的配合物最稳定，在o.5mol/mlH2SO4介质中仍能定量进行，而上述其他离子在此条件下不发生反应。第61页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.2选择适当的掩蔽剂使用掩蔽剂消除干扰是常用的有效方法。选取的条件是掩蔽剂不与待测离子作用；掩蔽剂以及它与干扰物质形成的配合物的颜色应不干扰待测离子的测定。第62页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.3利用生成惰性配合物

例如钢铁中微量钴的测定常用钴试剂为显色剂，但钴试剂不仅与Co2+发生反应，而且与Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等都有反应。钴试剂与Co2+在弱酸性介质中一旦完成反应后，即使再用强酸酸化溶液，该配合物也不会分解。Ni2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、等与钴试剂形成的配台物在强酸介质中很快分解，从而消除了上述离子的干扰，提高了反应的选择性。第63页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.4选择适当的测量波长例如在K2Cr2O7存在下测定KMnO4时不是选λmax(525nm)，而是选λ=545nm。这样测定KMn04溶液的吸光度，K2Cr2O7就不干扰。第64页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.5选择适宜的空白溶液空白溶液又叫参比溶液。空白溶液除用以校正仪器透光率100％或吸光度为零，除作为测量的相对标准外，在中药制剂分析中还用于消除干扰吸收。溶剂、试剂、器皿及试样本身都可能引入干扰因素。常见的空白溶液有：溶剂空白、试剂空白、试样空白、不显色空白、平行操作空白等。第65页，共118页，2023年，2月20日，星期三1、溶剂空白在测定入射光波长下，溶液中只有被测组分对光有吸收，而显色剂和其他组分对光无吸收，或虽有少许吸收，但所引起的测定误差在允许范围内，在此情况下可用溶剂作为空白溶液。第66页，共118页，2023年，2月20日，星期三2、试剂空白相同条件下只是不加试样溶液，依次加入各种试剂和溶剂所得到的溶液称为试剂空白溶液。适用于在测定条件下，显色剂或其他试剂、溶剂等对待测组分的测定有干扰的情况。第67页，共118页，2023年，2月20日，星期三3、试样空白与显色反应同样的条件取同量试样溶液，不加显色剂所制备的溶液称为试样空白溶液。适用于试样基体有色并在测定条件下有吸收，而显色剂溶液无干扰吸收．也不与试样基体显色的情况。第68页，共118页，2023年，2月20日，星期三4、不显色空白某些显色反应，当改变试剂加入顺序或某一操作（如加热改为不加热）时，可使被测组分与显色剂的显色反应不发生，这样配制的溶液称为不显色空白溶液。这种空白能够同时消除试样基体和试剂的干扰。第69页，共118页，2023年，2月20日，星期三5、平行操作空白如果容器、器材、溶剂、试剂以及环境可能带入被测组分或干扰组分时．可采用不含被测组分的试样基体作为空白试样，与试样在完全相同条件下平行操作，然后用此溶液为空白溶液，这种空白可当作一个试样来处理，测得的结果称为空白值，应从试样测得结果中减去。第70页，共118页，2023年，2月20日，星期三3.3.6分离若上述方法不宜采用时，也可以采用预先分离的方法，如沉淀、萃取、离子交换、蒸发和蒸馏以及色谱分离法等。此外，还可以利用化学计量学方法实现多组分同时测定。第71页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.1定性分析4.2定量分析4.3分光光度法的具体应用第四节分光光度法的应用第72页，共118页，2023年，2月20日，星期三1、比较吸收光谱曲线。2、比较最大吸收波长。3、比较吸光度比值。4.1定性分析第73页，共118页，2023年，2月20日，星期三定性分析缺点：紫外和可见光谱的特征吸收带是主要的定性依据，但在定性分析上的应用是有限的，因为其吸收带很宽，缺乏精细结构的特征，在定性方面不如红外吸收光谱。如果只有一两个发色团相同，其它部分的结构略有不同，对紫外和可见光谱影响变化不大，往往具有十分接近的吸收光谱。所以在鉴定化合物时要注意，即使是光谱相同，未必是同一种化合物，要采用其它分析方法配合进一步鉴定。第74页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2定量分析定量分析的依据是比耳定律、在液层厚度一定时，溶液的浓度与吸光度要成正比关系。标准曲线法、对比法、标准增量法，多组分混合物分析法，双波长分光光度法。第75页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2.1标准曲线法将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。第76页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2.2对比法先配制一种己知浓度的标准溶液C标，测其吸光度为A标，再在相同条件下测得样品溶液的吸光度为A样，根据下列公式求得样品浓度。此法可不做标准曲线．但要求溶液中的待测物质能严格符合光的吸收定律，而且样品溶液和标准溶液的吸光度值较为接近．这种方法的测定误差比标准曲线法要大一些。第77页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2.3标准增量法采用标准曲线法使未知样与标准样保持一致，在实际中并不是总能做到的，

采用增量法可以弥补这一缺点。方法是将未知样分成体积相同若干份，除其中一份不加已知被测组分外，其余都加，在合适条件下测定．如未知样不含被测组分，吸光值A应为零，曲线过原点。但实际没过原点，上截矩A1，校正后，曲线延长至OO’浓度为Cx如图。第78页，共118页，2023年，2月20日，星期三此法还可以检查实验过程的系统误差．设样品中校测组分真实含量为Cx．实验值为C1，在样品中增加已知量b时，测得实验值为C2，实验过程系统误差为k则：必要条件是当被测组分含量的变化时K不随其改变。第79页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2.4多组分混合物分析法当样品溶液中含有二种以上组分时，由于组分之间吸收峰相互干扰情况不同，计算方式也有所不同。①吸收光谱不重叠②吸收光谱重叠第80页，共118页，2023年，2月20日，星期三①吸收光谱不重叠。在λ1处B无吸收，在λ2处A无吸收，所以可分别在λ1及λ2处测定组分A和B的浓反，直接应用比尔定律计算。第81页，共118页，2023年，2月20日，星期三②吸收光谱重叠如果二组分各自的吸收光谱互相重叠，则混合物的吸收光谱为二组分各自吸收光谱的加和，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。Aλ1=εaλ1bca+εbλ1bcb

Aλ2=εaλ2bca+εbλ2bcb

第82页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.2.5双波长分光光度法不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。

ΔA＝Aλ2

－Aλ1

＝(ελ2

－ελ1)bc两波长处测得的吸光度差值ΔA与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。第83页，共118页，2023年，2月20日，星期三双波长分光光度法关键问题测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为:ΔAx和ΔAy。则该体系的总吸光度差ΔAx+y为：

ΔAx+y=ΔAx+ΔAy如何选择波长λ1

、λ2有一定的要求。第84页，共118页，2023年，2月20日，星期三波长组合λ1

、λ2的基本要求是：⑴选定的波长λ1和λ2处，干扰组分应具有相同吸光度，即：

ΔAy=ΔAyλ2-ΔAyλ1=0

故：ΔAx+y=ΔAx=(εxλ2-εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔA只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。第85页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.3分光光度法的具体应用4.3.1蛋白质测定双缩脲法考马斯亮蓝G250染色法4.3.2核酸测定4.3.3叶绿素的测定第86页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.3.1蛋白质测定蛋白质的分析是生物化学和其它生物学科、食品检验、临床诊断等领域最常涉及到的分析检测手段。由于蛋白质种类很多，分子组成、结构、分子量差别很大，功能各异，因此分析蛋白质含且的方法很多，各有其持点。分光光度法是目前最常用的一种方法．第87页，共118页，2023年，2月20日，星期三(1)双缩脲法利用双缩脲反应，蛋白质与二价铜离子在碱性溶液中形成紫色络合物，最大吸收波长在540nm，可测定含有10-1200ug/mL蛋白质样品，标准曲线的线性关系和重复性好．双缩脲试剂：硫酸铜1.5g，酒石酸钾钠6g，碘化钾1g，溶于适量水，搅拌状态下加入300mL10％氢氧化钠溶液，用水稀释至1000mL，在塑料瓶中贮存．标淮曲线绘制及样品测定：在试管中分别加入0.0，0.1，0.2，0.3、0.4，0.5，0.6mL标准蛋白液，用水补足到0.6ml，另取一份0.6mL样品，上述溶液中分别加入2.4mL双缩脲试剂，混均后室温放置15min，540nm处测定．第88页，共118页，2023年，2月20日，星期三(2)考马斯亮蓝G250染色法考马斯亮蓝G250，在酸性溶液中为棕红色，它和蛋白质通过疏水作用结合后产生颜色反应呈蓝色。在595nm处有最大光吸收，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸收值成正比，测定蛋白质浓度范围为l-140ug/mL，几乎无测定干扰，灵敏度较高。配制显色剂：将100mg考马斯亮蓝G250溶解于50mL95％的乙醇中。加入100mL85％的磷酸，加水稀释至1L。配制标准蛋白溶液：在试管中分别加入含0，10，20，30，40，50，60ug的标准蛋白质，加水至60uL．加3mL染色液，另取样品液也加3mL染色液，混匀后室温放置15min。595nm处测定。第89页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.3.2核酸测定由于核酸和蛋白质通常(结合在一起)以核蛋白的形式存在，所以在提纯核酸的过程中．要测定其中蛋白质杂质的含量。通过两个波长(260nm/280nm)的吸收读数比率和空白的校正，即可估算核酸的纯度。DNA比值为1.8，RNA比值为2.0。对核酸来说，260nm/280nm的比值越小，说明蛋白杂质越多，两个波长吸收比率小于所规定的最小值，则核酸纯度不符合要求。第90页，共118页，2023年，2月20日，星期三常涉及到用于测定核酸样品的波长有4个①230nm，肽键的吸收波长，用此波长检测蛋白质的含量比280nm处更灵敏．但常用缓冲液(如Tris等)对测定有干扰。②280nm，蛋白质中芳香族氨基鼓的吸收波长，由于干扰少，经常使用。③260nm，大多数单核苷酸的最大吸收波长均在260nm附近，用来检测核酸的含量。④320nm，用于本底校正，核酸和蛋白质在此波长下无吸收，一些干扰因素（如散射光）可产生吸收。为使用方便起见，将上述4种波长按不同组合编成四个固定的指定参数方法。第91页，共118页，2023年，2月20日，星期三核酸测定的四种指定的参数法：(1)测定260nm/280nm及280nm/260nm的比率。(2)测定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，背景校正波长320nm。(3)测定230nm/280nm及260nm/230nm的比率，背景校正波长320nm。(4)测定260nm/280nm及280nm/260nm的比率，用Warburg和Christian系数计算蛋白质和核酸浓度。第92页，共118页，2023年，2月20日，星期三核酸中的嘌呤、嘧啶、蛋白质中的酪氨酸、色氨酸都有共轭双键，分别在波长260nm、280nm处有紫外吸收。由于各种核酸、蛋白的差异很大，为了更准确的测定核酸和蛋白质的浓度，用经典浓度公式，即Warburg和Christian浓度公式测定核酸和蛋白质浓度．蛋白质(ug/mL)＝1552×A280－757.3×A260核酸（ug/mL）＝62.9×A260－

36×A280第93页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.3.3叶绿素的测定将2g鲜重叶片放在干净研钵内，加40mL80％丙酮，把组织研磨匀浆，研磨大约3min，小心地把绿色液体转移到一个垫有滤纸的漏斗内，当过滤提取液时(抽滤)，用另外30mL80％丙酮重复研磨所剩物成匀浆，3-4min之后，如前一样将第二次提取液过滤到含第一次提取液的烧瓶里。最后用80％丙酮将滤液定容至100mL。叶绿素有叶绿素a和叶绿素b，它们分别有持征吸收光谱。在丙酮提取液中，叶绿素a在波长663nm；叶绿素b在波长645nm有吸收蜂。第94页，共118页，2023年，2月20日，星期三式中Ca、Cb分别为叶绿素a及叶绿素b的浓度，为了便于区别用d代表光径。当d=1.0cm，C取mg/mL为单位时，其ε值已由实验测定，分别为：

εa1=82.09εb1=9.24εa2=16.75εb2=45.6叶绿素提取液的消光度在两种波长下分别为A1及A2，它们可写为：第95页，共118页，2023年，2月20日，星期三可得到每克叶片中所含叶绿素的毫克数:W为叶片的鲜重、单位为克．V是80％丙酮-叶绿素提取液的最终体积，单位为毫升．测量时以80％丙酮为空白对照，比色池的光径为10mm。第96页，共118页，2023年，2月20日，星期三另外，叶绿素a、b的等吸收点在652nm，故可在652nm测定。第97页，共118页，2023年，2月20日，星期三4.3.4酶动力学研究分光光度法是酶动力学研究最有效的工具。通过酶促反应动力学的研究，有助于了解酶与底物的结合机制和作用方式、酶的底物浓度与酶促反应速度的关系符合米氏理论。第98页，共118页，2023年，2月20日，星期三第五节原子吸收分光光度法1802年，发现原子吸收现象：原子蒸气对其原子共振辐射吸收的现象；1955年，澳大利亚物理学家WalshA（瓦尔西）发表了著名论文：《原子吸收光谱法在分析化学中的应用》，奠定了原子吸收光谱法的基础，之后迅速发展。第99页，共118页，2023年，2月20日，星期三原子吸收光谱法特点：(1)检出限低，10-10～10-14g；(2)准确度高，误差在1%～5%；(3)选择性高，一般情况下共存元素不干扰；(4)应用广，可测定各种样品中70多个元素。原子吸收光谱法局限性：(1)难熔元素、非金属元素测定困难(2)不能同时多元素第100页，共118页，2023年，2月20日，星期三第六节荧光分析法某些物质经紫外线照射后，能立即放出能量较低（亦即波长较长）的光。当照射停止后，如化合物的发射在10-9秒钟内停止，则称荧光超过此限度即称为磷光。荧光的波长与被照射物质有关。以紫外线作激发光源，所发射的荧光常在可见光区。测量荧光强度以确定物质含量的方法叫做荧光分析法，所使用的仪器叫荧光计。第101页，共118页，2023年，2月20日，星期三6.1原理设IF为荧光强度；I0入射紫外线强度；It为透过溶液后紫外线强度；Ia为溶液吸收紫外线；则：Ia=I0-ItC为溶液中被测物质的浓度；l为溶液层的厚度。第102页，共118页，2023年，2月20日，星期三据朗伯-比尔定律A=εlc经数学推导，当浓度很小时：又Ia=I0-It，则第103页，共118页，2023年，2月20日，星期三荧光强度IF与物质吸收紫外线的强度成正比当紫外线的强度一定，溶液的