保健品检测卫生检验优秀课件

保健品检测卫生检验第1页，共82页，2023年，2月20日，星期三第二十章健康相关产品的免疫学检验第2页，共82页，2023年，2月20日，星期三前言

健康相关产品：

是指保健食品、化妆品、涉及饮用水卫生安全产品、消毒产品等与人体健康密切相关的产品。第3页，共82页，2023年，2月20日，星期三第一节有毒有害物质的免疫学检验一、免疫学技术在环境中有毒有害物质检测中的应用检测奶、肉、蛋、肝、蔬菜水果等食品中残留的农药（杀虫剂、除草剂）、残留的抗生素。检测水和土壤中残留的农药。水中藻毒素。谷物及其制品中的霉菌毒素。保健功能食品中的激素、毒品、兴奋剂等。

国外已有多种检测试剂盒应用，抗体多为单克隆抗体，而且把免疫学技术与自动化分析仪器相结合，如免疫亲和柱、高效液相色谱法、免疫亲和柱－荧光分光光度法。第4页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物质免疫学检测方法（一）RIA法（放射免疫分析）应用：环境样品中的杀虫剂、除草剂、激素的测定。缺点：放射元素的污染，特殊的分析仪器。第5页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物质免疫学检测方法（二）ELISA法应用最多的技术类型，是竞争抑制法。ELISA主要用于食品中残留农药、抗生素、激素的检测。谷物中真菌毒素的检测和水中藻毒素的检测。第6页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物质免疫学检测方法（三）酶增强免疫测定技术（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）用途：用于半抗原或小分子抗原的检测。原理：将这类抗原接合在酶分子活性点附近，如与相应抗体结合则封闭了该活性点位，使酶失活，测定时将待测样品、酶标抗原（半抗原）、特异性抗体一起混合，加酶底物，测定反应体系中酶的活性。由于样品中待测抗原与酶标记抗原竞争结合反应体系中限量的抗体，从而使游离酶标抗原量增多，最终测得的酶活性随着反应体系中未标记待测抗原的浓度升高而增强。第7页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物质免疫学检测方法（四）斑点金免疫层析试验（dotimmunogoldchromatographicassay,DICA）是胶体金标记技术和蛋白质层析技术相结合的以微孔滤膜为载体的快速定性或半定量筛查试验。应用：毒品、霉菌毒素的检测等。

第8页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、有毒有害物质免疫学检测方法

（五）免疫磁珠用于定量、半定量检测环境中残留的农药。第9页，共82页，2023年，2月20日，星期三三、有毒有害物质免疫学检测的应用(一)残留农药的检测1.ELISA法应用：检测食品、土壤、水中残留的有机氯、有机磷、甲苯胺、滴灭威、多菌灵、百草枯、拟除虫菊酯，三嗪类等杀虫剂、除草剂等。优点：比用气相色谱或高效液相色谱方法所用的试剂费要低20倍，对样品的处理方法也比较简单，且两者的最低检出限及回收率均吻合。

第10页，共82页，2023年，2月20日，星期三三、有毒有害物质免疫学检测的应用(一)残留农药的检测

2.金免疫层析法已有对有机磷（甲基对硫磷、乙基对硫磷）、杀螟硫磷、毒死蜱、呋喃丹等农药检测的商品胶体金试剂盒。第11页，共82页，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的检测1．黄曲霉毒素的检测（1）ELISA法主要适用于大批量样品的定性、定量分析，与常规标准方法符合率较高。缺点是只能检测一种毒素。（2）金标记试纸法非常适于现场检测和大量样品初筛。

第12页，共82页，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的检测1．黄曲霉毒素的检测（3）免疫亲和柱的应用黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1单克隆抗体免疫亲和柱均已商品化，用于各种食品、饲料和体液样品纯化、浓缩，为进一步的仪器定量检测奠定了基础。

第13页，共82页，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的检测2．玉米赤霉烯酮（ZEN）小麦中玉米赤霉烯酮ELISA检测已纳入国家标准方法（GT/T14933-94）。有高灵敏度的ELISA试剂盒商品提供。商品玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，与荧光计相连接可检测饲料中的玉米赤霉烯酮检测范围为10－200ng/g。检出限为4ng/g，总回收率为94％，检测结果与HPLC法吻合。第14页，共82页，2023年，2月20日，星期三(二)真菌毒素的检测3．脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）我国已把小麦、面粉、玉米粉中DON的ELISA检测和TCL纳入限量标准制定的检测方法。现有高灵敏度的ELISA检测DON试剂盒商品。DONtest免疫亲和柱已有商品供应，可与色谱法结合应用。第15页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）人工合成有毒污染物的检测1．二噁英的检测双抗体放射免疫分析ELISA法定量检测2．多氯联苯的检测

ELISA试剂盒用PCB3多克隆抗体包被磁珠，用于定性、半定量、定量检测土壤、水、沉淀物、鱼浆中的PCB3，检测范围为0.25～25.0ppb。第16页，共82页，2023年，2月20日，星期三第二节化妆品的免疫学检验第17页，共82页，2023年，2月20日，星期三第18页，共82页，2023年，2月20日，星期三第19页，共82页，2023年，2月20日，星期三第三节保健食品免疫学检验和评价第20页，共82页，2023年，2月20日，星期三前言

为了规定评价保健食品功能的统一程序和试验规程，卫生部于2003年2月颁发了保健食品检验与评价技术规范，在确定的检验机构对其功能学评价方法和试验结果进行验证后，方能向SFDA（StateFoodandDrugAdministration）申报，批准后才可进入市场。第21页，共82页，2023年，2月20日，星期三前言

保健食品功能的试验和评价的项目从原来的22项增加到27项，主要有增强免疫功能，辅助降血脂功能，辅助降血糖功能，抗氧化功能，辅助改善记忆功能，缓解疲劳功能，促进排铅功能等等，保健食品的免疫学检验，主要用于对其增强免疫力功能的验证与评价。第22页，共82页，2023年，2月20日，星期三一、增强免疫力功能检验项目

（MethodfortheAssessmentofEnhancingImmuneFunction）（一）细胞免疫功能的检测（二）体液免疫功能的检测（三）单核巨噬细胞功能的检测（四）NK细胞功能的检测ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验小鼠迟发型变态反应抗体生成细胞检测血清溶血素的测定小鼠碳廓清实验小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验乳酸脱氢酶（LDH）测定法第23页，共82页，2023年，2月20日，星期三一、增强免疫力功能检验项目实验动物推荐用近交系小鼠，18-22g，单一性别，每组10-15只。剂量分组及受试样品给予时间实验至少应设三个剂量组和一个阴性对照组，必要时设阳性对照组或空白对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。第24页，共82页，2023年，2月20日，星期三对受试样品处理的要求受试样品推荐量较大，超过灌胃量，可以适当减少样品中非功效成分的含量，或浓缩。如：60-70℃减压浓缩。对合理设置对照组的要求以载体和功效成分组成的受试样品，当载体本身可能具有相同功能时，应将该载体作为对照。第25页，共82页，2023年，2月20日，星期三二、免疫学检验方法（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）

1．原理：当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解酶将MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

ConA刺激48~72小时第26页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）

2.仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4)纱布或200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底),手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。第27页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）3.试剂配制完全培养液：RPMI1640培养液过滤菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（20mmol/L)，青霉素（100U/mL),链霉素（100g/L)及5×10mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HC1或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2,即完全培养液。ConA液：用双蒸水配制成100g/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(-20)保存。无菌Hank‘s液：用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。MTT液：将5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液：96mL异丙醇中加入4mL1mol/L的HC1，临用前配制。第28页，共82页，2023年，2月20日，星期三4.技术要点：

（1）脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液平皿中。用4层纱布将脾磨碎，制成单个细胞悬液。用Hank’s液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1ml的完全培养液中。用台盼兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/ml。（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）第29页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）（2）淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml。一孔加75μlConA液（相当于7.5μg/ml），另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）50μl/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。第30页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）（3）实验中ConA的浓度的确定选择有丝分裂原时ConA的浓度很重要，ConA的浓度过高会产生抑制作用，不同批号的ConA在实验前要预试，以找到最佳刺激分裂浓度。第31页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）5．结果判定：淋巴细胞的增殖能力=加ConA孔的光密度值–不加ConA孔的光密度值

受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。第32页，共82页，2023年，2月20日，星期三（一）ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验（MTT法）6.数据处理

一般用方差分析，先检验方差齐性，方差齐，计算F值，F值<F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换；若变量转换仍达不到要求，改用秩和检验进行统计。第33页，共82页，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）1．原理二硝基氟苯（DNFB）是一种半抗原，将其稀释液涂抹小鼠腹壁皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。4d～7d后再将其涂抹于耳部，使局部产生迟发型变态反应。一般在抗原攻击后24h～48h达高峰，故于此时测定其肿胀程度。第34页，共82页，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）2.材料DNFB、丙酮、麻油、硫化钡、打孔器3.试剂配制DNFB溶液：应新鲜配制，称取DNFB50mg，置清洁干燥小瓶中，将预先配制好的5ml丙酮麻油溶液（v/v=1:1），倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250µl注射器通过瓶盖取用。第35页，共82页，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）4.技术要点（1）致敏小鼠腹部皮肤用硫化钡脱毛，范围约3cm×3cm，用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏。（2）迟发性变态反应的产生与测定5天后，用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。第36页，共82页，2023年，2月20日，星期三（二）二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型变态反应（耳肿胀法）5.结果判定

用左右耳重量之差表示迟发型变态反应的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。6.注意事项操作时避免DNFB与皮肤接触。第37页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）1．原理

用绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数大体可反映抗体分泌细胞数。第38页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）2.仪器和材料二氧化碳培养箱、恒温水浴箱、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC、补体（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。第39页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）3.技术要点（1）SRBC绵羊红细胞的制备绵羊颈静脉取血。将羊血放入有玻璃珠的灭菌锥形瓶中，朝一个方向摇动，以脱纤维。放入4℃冰箱保存备用，可保存2周。第40页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）（2）制备补体采集豚鼠血，分离出血清（至少5只豚鼠的混合血清）。将1ml压积SRBC加入到5ml豚鼠血清中。4℃冰箱放置30min，经常振荡。离心取上清，分装，－70℃保存。用时以SA缓冲液按1∶8～15稀释。第41页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）（3）玻片涂膜在清洁玻片上刷上一薄层琼脂（0.5%），干后可长期保存备用。第42页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）（4）免疫动物取脱纤维羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min，计数细胞。每只鼠经腹腔或静脉注射SRBC5×107～2×108个。也可将压积SRBC用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2ml。第43页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）（5）脾细胞悬液制备将SRBC免疫4～5d后的小鼠颈椎脱臼处死。取出脾脏，放在盛有Hank‘s液的小平皿内，用4层纱布将脾磨碎，制成细胞悬液，离心10min（1000r/min），用Hank’s液洗2遍。最后将细胞悬浮在5mlRPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/ml。第44页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）（6）空斑的测定将表层培养基（1%琼脂糖）加热溶解后，放45℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank‘s液混合，分装小试管，每管0.5ml。再向管内加50μl10%SRBC(v/v，用SA液配制)，20μl脾细胞悬液（5×106个/ml），迅速混匀，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片。待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1～1.5h。然后用SA缓冲液稀释的补体（1：8）加入到玻片架凹槽内。继续孵育1～1.5h后，计数溶血空斑数。第45页，共82页，2023年，2月20日，星期三（三）抗体生成细胞检测（Jerne改良法）4.结果判定用空斑数/106脾细胞表示。

受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。第46页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定

1.原理用SRBC免疫动物后，血清中出现SRBC抗体（溶血素），在补体参与下，与SRBC一起孵育，可发生溶血反应，释放血红蛋白，通过测定血红蛋白含量反映动物血清中溶血素的含量。第47页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定

2.仪器和材料分光光度计、离心机、恒温水浴、SRBC、补体（豚鼠血清）、SA缓冲液、都氏试剂（碳酸氢钠1.0g、高铁氰化钾0.2g、氰化钾0.05g,加蒸馏水至1000mL）第48页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定3.技术要点（1）SRBC制备（2）制备补体

第49页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定（3）免疫动物及血清分离取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心（2000r/min）10min。将压积SRBC用生理盐水配成2%（v/v）的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4-5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，使血清充分析出，2000r/min离心10min,或6000r/min,4min,收集血清。第50页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定（4）溶血反应取血清用SA缓冲液稀释（一般为200-500倍）。将稀释后的血清1mL置试管内，依次加入2%(v/v)SRBC0.5mL,补体1mL（用SA液按1：8稀释），另设不加血清的对照管（以SA缓冲液代替）。置37℃恒温水浴中保温15-30min后，冰浴终止反应。2000r/min。取上清液1mL，加都氏试剂3mL,同时取2%(v/v)SRBC0.25mL加都氏试剂至4mL,充分混匀。放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。第51页，共82页，2023年，2月20日，星期三（四）血清溶血素的测定

半数溶血值（HC50）的测定（5）结果判定溶血素的量以半数溶血值（HC50）表示，按下列公式计算。

样品光密度值

HC50=×稀释倍数

SRBC半数溶血时的光密度值受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。第52页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验1．原理在一定范围内，体内碳颗粒的清除速率与其剂量呈指函数关系。以血碳浓度对数值为纵坐标，时间为横坐标，两者成直线关系。此直线斜率（K）可表示吞噬速率。动物肝、脾重量影响吞噬速率，一般以校正吞噬指数a表示。第53页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验2.仪器和试剂

721分光光度计、计时器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO3第54页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验3．技术要点（1）注射用墨汁配制将印度墨汁原液用生理盐水稀释3～4倍。（2）注射墨汁称小鼠体重，从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁，按每10g体重0.1ml计算。待墨汁注入，立即计时。第55页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验（3）测定注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μl，并立即将其加到2ml0.1%Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值（OD）。以Na2CO3溶液作空白对照。第56页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验（4）肝脾称重

将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，称重。第57页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验4．结果判定

以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。按下式计算吞噬指数a。

lgOD1-lgOD2K＝───────

t2－t1

体重吞噬指数a＝───────×3√K

肝重＋脾重

受试样品组的吞噬指数显著高于对照组的吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。第58页，共82页，2023年，2月20日，星期三（五）小鼠碳廓清实验5.注意事项静脉注入碳粒的量、取血时间、取血量一定要准确。墨汁放置中，碳粒可沉于瓶底，临用前应摇匀。使用新的墨汁时，应在实验前摸索一个最适墨汁注入量，即正常小鼠在20min内不容易廓清。第59页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）

1.原理：是利用巨噬细胞对光滑表面如玻璃表面具有粘附的特性，将含有巨噬细胞的腹腔液滴于载玻片上，加入鸡红细胞，孵育一定时间后，冲洗掉无粘附力或粘附力差的细胞，固定染色，，获得以巨噬细胞为主的标本，在显微镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比和吞噬指数，据此判定巨噬细胞的吞噬能力。第60页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）2.仪器和材料显微镜、37℃孵箱、计数器、手术器械一套、注射器、滴管、胶头吸管、吸耳球、载玻片、染色槽、试管第61页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）3．技术要点（1）1％鸡红细胞悬液：实验前取鸡颈静脉或动脉血，置于盛有玻璃珠（20个左右）的三角瓶内，连续顺一个方向充分摇动5min～10min，除去纤维蛋白，4℃冰箱保存。实验前用生理盐水洗涤3次，每次1500r/min，离心10min，弃去上清。按血球压积用Hank’s液配制成1％的红细胞悬液。第62页，共82页，2023年，2月20日，星期三去纤维蛋白第63页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）（2）小鼠巨噬细胞的激活:实验前4d给每只小鼠腹腔注射2%压积羊血红细胞0.2ml。用颈椎脱臼法处死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank‘s液4ml/只，轻轻按揉腹部数次。然后将腹壁剪开一个小口，用胶头吸管吸取腹腔洗液2ml于试管内（或用注射器）。用1ml加样器吸取腹腔洗液0.5ml加入盛有0.5ml1％鸡血红细胞悬液的试管内，混匀。用注射器（装大针头）吸取0.5ml混合液，加入玻片。放置孵箱内37℃孵育15～20分钟。孵育结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1分钟，Giemsa液染色15分钟。用蒸馏水冲洗干净，晾干。第64页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）（3）实验操作过程中应严格掌握时间。

怎样解决各实验组玻片作用时间不一致的误差？？第65页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）（4）计数

用40×显微镜计算吞噬率和吞噬指数。每张片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数吞噬百分率（%）=───────────────×100

计数的巨噬细胞数

被吞噬的鸡红细胞总数吞噬指数=─────────────

计数的巨噬细胞数第66页，共82页，2023年，2月20日，星期三小鼠腹腔中分离巨噬细胞第67页，共82页，2023年，2月20日，星期三腹水中巨噬细胞第68页，共82页，2023年，2月20日，星期三巨噬细胞第69页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）4．结果判定

以吞噬百分率或吞噬指数表示小鼠巨噬细胞的吞噬能力。

受试样品组的吞噬百分率、吞噬指数与对照组吞噬百分率、吞噬指数比较，差异均有显著性，方可判定该项实验结果阳性。第70页，共82页，2023年，2月20日，星期三（六）小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验（滴片法）5.注意事项颈椎脱臼处死小鼠勿用力过大，防止腹腔内血管和内脏破裂出血影响实验结果。放滴片的搪瓷盘内应保持一定的湿度，以防液体干燥。孵育后的标本冲洗次数的差别不宜太大，更不要直接冲在有细胞的部分。在镜下计数细胞时要数完一个视野后再换另一个视野。第71页，共82页，2023年，2月20日，星期三（七）NK细胞活性测定－乳酸脱氢酶（LDH）测定法1．原理活细胞的胞浆内含有LDH。正常情况下，LDH不能透过细胞膜，当细胞受到NK细胞的杀伤后，LDH释放到细胞外。LDH可使乳酸锂脱氢，进而使NAD还原成NADH，后者再经递氢体吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）还原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受H＋被还原成紫红色甲臢类化合物。在酶标仪上用490nm比色测定。第72页，共82页，2023年，2月20日，星期三（七）NK细胞活性测定－乳酸脱氢酶（LDH）测定法2.仪器和材料酶标仪、YAC-1细胞、Hank’s液（PH7.2-7.4）、RPMI1640完全培养液、乳酸锂、硝酸氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）、NAD、0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（PH8.2）、1%NP40或2.5%Triton第73页，共82页，2023年，2月20日，星期三（七）NK细胞活性测定－乳酸脱氢酶（LDH）测定法3.试剂配制LDH基质液的配制乳酸锂5×10-2mol/L硝酸氯化四氮唑（INT）6.6×10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸盐（PMS）2.8×10-4mol/L氧化型辅酶I（NAD）1.3×10-3mol/L将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液（PH8.2）中。第74页，共82页，2023年，2月20日，星期三（七）NK细胞活性测定－乳酸脱氢酶（LDH）测定法4．技术要点（1）靶细胞的传代（YAC-1细胞）实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank‘s液洗3次。用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml。第75页，共82页，2023年，2月20日，星期三（七）NK细胞活性测定－乳酸脱氢酶（LDH）测定法（2）脾细胞悬液的制备（效应细胞）无菌取脾，置于盛有适量无