免疫荧光实验

免疫荧光实验——iPSC-derive神经元的体外神经毒性检测如今神经毒性检测主要是依赖活体动物实验，不仅有伦理问题，而且通常非常昂贵并且十分耗时。当需要大规模的测试化合物的时候就不太合适了。因此，高通量的体外的神经毒性测试就显得十分必要了，而且可以使用人源的细胞直接进行试验，试验结果的实用性也更佳。但是，到目前为止，人源干细胞诱导的神经元并没有适合进行这类试验的特质，试验时间较长，批次间差异大，并且有收到伦理和一些法律的制约，使得这种细胞都不太适用于做大规模的体外测试试验。最近，市面上出现了商用的人源iPSC-derive神经元细胞，重复性好，可以用来做这类的体外神经毒性试验。荷兰的科学家使用人源iPSC-derive神经元细胞做了免疫荧光染色试验，作为高通量进行体外的神经细胞毒性检测的预试验。由不同供应商提供的人源iPSC-derive神经元细胞混合培养能够形成不同(激活型或抑制型)神经元共培养的样本。ALTEX.2016Mar24.doi:10.14573/altex.1510091IsthetimerightforinvitroneurotoxicitytestingusinghumaniPSC-derivedneurons?TukkerAM1,deGrootMW1,WijnoltsFM1,KasteelEE1,HondebrinkL2,WesterinkRH1.一、实验材料细胞：iCell®Neurons(NRC-100-010-001，CellularDynamicsinternational)CDIiCell®Astrocytes(CellularDynamicsinternational)HIPneurons(GSC-4312,MTI-GlobalStem)DOPA.4U®neurons(Axiogenesis,Cologne,Germany)培养基:CompleteiCellNeuronsMaintenanceMedium(with2%iCellNeuronsMediumSupplement)supplementedwithlaminin(10pg/mL)试剂:Poly-L-Ornithine([PLO]0.01%)4)培养耗材:口-Slide8孔腔室载玻片，ibiTreat底部处理(ibidi，Germany，80826)、实验方法)载玻片包被每孔加入300pl的0.01%的Poly-L-Ornithine溶液室温孵育60分钟吸除所有液体并小心用PBS冲洗5-10分钟，即可开始使用)免疫荧光实验1）铺细胞：iCell®Neurons每孔铺100000个细胞iCell®Neurons/CDIiCell®Astrocytes共培养，每孔铺66000个细胞HIPneurons每孔铺100000个细胞DOPA.4U®neurons每孔铺52000个细胞DOPA.4U®neurons/iCell®Astrocytes共培养，每孔铺48000个细胞2） 加入约300p1/孔的4%多聚甲醛的PBS溶液，静置15分钟3） 加入300pl1%Triton®X-100的PBS溶液通透3-5分钟4） 加入300pl2%BSA的PBS溶液封闭20分钟5） 依次加入一抗，二抗进行免疫荧光染色后，冲洗小室并加入封片液进行显微镜观察（图二）。图二：图示铺细胞，固定，清洗，染色步骤。三、实验结果

DIV14-|3(|l|)Tubulin/ /DIV8-PDIV14-|3(|l|)Tubulin/ /DIV8-P(MI)Tubulin/ /DJV14-p(lll)Tubwiin/DIVS-vGAl//|«■DOPA.4U-astrocYteco-ciiltureiCellNeuron-astrocyteco-cultureHIPheurons图三：iPSC-derive神经元的免疫荧光染色结果。不同种类的人源iPSC-derive神经元使用0（lll）tubulin（绿色）和GFAP（红色），用来区分神经元和星型胶质细胞（HIP®neurons,左上；DOPA.4U®ne