分光光度技术

分光光度技术一.概念分光光度法(Spectrophotogniphy),又称为比色法，它是采用物质特有的汲取光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技术。有色溶液对光线有选择性的汲取作用，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长的光的汲取力量不同，因此，每种物质都具有其特异的汲取光谱。比色法只限于可见光区，分光光度法可扩展到紫外光区和红外光区。使用的光谱范围200—lOOOnm紫外光区：200-400nm可见光区：400—760nm红外光区：760-lOOOnm二.基本原理物质的汲取光谱与它们的本身的分子结构有关，不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的汲取力量也不同。每种物质都具有特定的汲取光谱，在肯定条件下，其汲取程度与该物质浓度成正比，因此可采用各种物质不同的汲取光谱及其强度，对不同物质进行定性和定量分析。分光光度法依据的原理是Lambert-Beer定律，该定律阐明白溶液对单色光汲取程度与溶液浓度及溶液厚度之间的关系。.朗伯(Lambert)定律：当单色光通过一汲取光的介质时，其光强度随汲取光介质的厚度增加而成指数削减，即I/Io=eK1LIo：入射光强度，I：出射光强度，L：介质的厚度e:自然对数的底，即2.718K/••溶液的吸光率In(Io/I)=Kil换算成常用对数式，即log(Io/I)=0.4343•Kil令K=O.4343・K1则log(10/1)=K1此处以K为吸光率也就是说：在溶液浓度不变时，溶液对光的汲取随溶液厚度的增大而增大。.比尔(Beer)定律：单色光通过一光汲取介质时，光强度随介质浓度增长而成指数削减，即I/Io=e-K2LC：溶液浓度log(Io/I)=KC也就是说：溶液厚度不变时，溶液对光的汲取随溶液浓度的增大而增大。.Lambert—Beer定律假如同时考虑汲取溶液的浓度和厚度对光汲取的影响，将以上两式结合，则得出log(Io/I)=KC1令丁二(I/Io)A=log(Io/I)则A=KC1A为吸光度，T为透光度TTCL-nior^cm-1)是一常数，即削光系数，也叫摩尔吸光度；三.计算.标准管法(标准比较法)用一已知浓度的测定物按测定管同样处理显色，读出吸光度，在依据公式计算。Ai=KiCiLiA2=K2c2L2Ai：已知浓度标准管A2：未知浓度测定管Ai/A2=(K1C1L1)/(K2C2L2)由于使用的比色杯径长相同，即Li=L2,所以上式可改写为：Ai/A2=(K1C1)/(K2C2)又由于标准液和测定液中的溶质为同一物质，所以K值相同，即：Ki=K2所以上式可改写为A1/A2=C1/C2所以C2=(A2/A1)Cl试验中，由于比色皿本身和溶剂也会产生肯定的光汲取，所以设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其他的成分完全相同。以空白管对准光路对仪器调零,消退非待测物的汲取，所测值即为待测物的光汲取。.标准曲线法制备一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处理显色，分别读取各管吸光度三.仪器的结构.定义：对某一波长的光汲取值(吸光度)进行测定的仪器称为分光光度计。.分类：依据所测光谱范围分为：紫外、可见、红外分光光度计及万用(全波段)分光光度计。.结构组成①光源：要求能供应所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度。常用光源有：鸨灯或卤铝灯：工作范围360—lOOOnm,用于可见光区，近紫外光区和近红外光区氢灯或笊灯：工作范围150—400nni,可作紫外光分光光度计的光源②分光系统(单色器)：把混合光分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件，将不同波长的光分开③汲取池(比色皿、比色池)：用来盛待测溶液。一般用玻璃、石英制成。小于330nm的光不能用玻璃比色皿，所以紫外汲取时要用石英比色皿。④检测器：光电池、光电管、光电倍增管组成⑤测量装置：以电流表、波长分度盘和测量读数盘的形式输出测量结果，现代的仪器长附有自动纪录器，可自动描出纪录曲线。蛋白质化学试验一.双缩麻测定蛋白含量.原理：蛋白分子中含有很多肽键，与双缩版结构类似，在碱性溶液中与Cu2+结合形成紫色化合物，此反应称为双缩胭反应，紫色化合物在520nm波长下有最大光汲取。在肯定浓度范围内，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，所以可用比色法测定蛋白质含量。含有两个以上肽键的物质才有此反应，故氨基酸无此反应。2.方法：采纳标准曲线法①标准曲线制作（1）取小试管6支，编号，按下表操作双缩胭法操作步骤表试剂（mL）管号123456标准蛋白质溶液0.10.30.50.70.9—生理盐水0.90.70.50.30.11.0双缩胭试剂4.04.04.04.04.04.0（2）混匀后，于37℃水浴中保温15min,在520nm波长下比色，以第6管调零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度的克数为横坐标，绘成曲线。②样品测定取蛋白质样品0.1mL,加生理盐水0.9mL,再加双缩月尿试剂4mL,于37。。水浴中保温15min,在520nm波长下比色，测得其吸光度，依据吸光度值查标准曲线即得出每100mL样品中蛋白质的克数。二.考马斯亮兰法测定蛋白质含量L原理：考马斯亮兰G250存在着两种不同的颜色，红色和蓝色。它与蛋白质通过范德华力结合，染料与蛋白质结合后颜色由红色变成蓝色，最大汲取峰从465nm变成595nm,通过测定595nm处的光汲取的增加量可知与其结合蛋白质的量。此结合物1小时内稳定。.优点：灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达lug;测定速度快、简便，只需一种试剂；干扰物质少。.方法：采纳标准管法①取试管3支，编号，按下表操作考马斯亮兰法测定蛋白质表试剂（血）空白管标准管标本管一TOC\o"1-5"\h\z生理盐水671标准蛋白溶液0.1样品0.1考马斯亮兰试剂5.05.05.0②混匀，室温放置5min,在波长595nm处，以空白管调零点。测定各管的吸光度值。③计算（切标本/勿标准）X50=样品中蛋白质的含量Hg/mL三.紫外分光光度法测定蛋白质含量.原理：蛋白质分子中含有的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸残基的苯环含有共辄双键，使蛋白质具有汲取紫外光的性质，汲取高峰在280nm波特长。由于各种蛋白质所含芳香族氨基酸的量相差很少，因此在此波长范围内汲取峰的吸光度值与其浓度成正比，可作定量测定。由于各种蛋白质中芳香族氨基酸含量的不同，因而此法适于测定与所采纳的标准蛋白质的氨基酸组成相像的蛋白质，以削减误差。一般核酸在280nm波特长也有汲取，对蛋白质测定有干扰作用，但核酸的汲取高峰在260nni,因此溶液中同时存在核酸时，必需同时测定〃£嬴。和桃也通过计算消退核酸对蛋白质的影响算出蛋白质的含量。由于蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸在280nm处具有最大汲取，且各种蛋白质的这三种氨基酸含量差别不大，因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外汲取法。.方法：采纳标准曲线法①标准蛋白质溶液：任选一种蛋白质溶液，经凯氏定氮法测定蛋白质的含量，用生理盐水稀释至浓度为Img/mLo取试管6支，编号，按下表操作。紫外汲取法标准曲线制作步骤表混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第6管调零点，在280nm波长下测定各管的吸光度值，以各管的吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度的