第三节冷冻蚀刻样品制备技术课件

第三节冷冻蚀刻样品制备技术课件演示文稿现在是1页\一共有21页\编辑于星期五（优选）第三节冷冻蚀刻样品制备技术课件现在是2页\一共有21页\编辑于星期五

出割断面上各种细胞器的膜结构，这一过程称为蚀刻。然后以不同的角度在经过蚀刻的断面上喷上一层铂和碳的投影膜，在断面上形成一层复型膜；最后取出经喷镀的样品，把有机组织腐蚀掉，将复型膜捞在铜网上，用透射电镜观察。在复型膜上不仅能观察到细胞器的各种膜结构，而且还能观察到细胞的连接装置，核膜孔、膜内颗粒等。此外，图像的立体感强、分辨率高（可达2.5nm），而且复型膜可长期保存。但用该技术制作样品耗费高，成功率较低，技术程序较复杂，一般不易掌握。

现在是3页\一共有21页\编辑于星期五

示核孔示高尔基复合体和线粒体现在是4页\一共有21页\编辑于星期五二、样品制作前的准备工作

1、仪器设备：冷冻蚀刻仪，封闭式FD-2A型，日本日立公司生产；开放式是用真空喷镀仪（HUS-5GB型与冷却割断装置HFZ-1日立产）配合组成。

2、试剂：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）、0.1mol／L磷酸缓冲液(PH7.2～7.4)；20%、30%的甘油-生理盐水（pH7.2～7.4）；腐蚀液（次氯酸钠）、液氮、30％的丙酮水溶液、蒸馏水、光谱纯碳棒和黄金丝或铂丝等。

3、器皿：冰盒、蜡板、双面刀片、解剖器械、牙签、滴管、立体解剖镜、弯头专用镊子、牙科镊子、铝制的提勺等。现在是5页\一共有21页\编辑于星期五

HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图

现在是6页\一共有21页\编辑于星期五

FD---2A冷冻蚀刻仪现在是7页\一共有21页\编辑于星期五

三、样品制作步骤（以开放式冷冻蚀刻装置为例）

1、样品的取材、固定和防冻处理：将实验动物迅速杀死，在1分钟之内取出肝脏等组织，迅速放入预冷的2.5％的戊二醛内，稍固定一段时间后，在蜡板上滴加少量冷固定液，将组织切成细条状，其大小为3×1×1.5mm，再放入2.5％的戊二醛中固定15～20分钟，组织变硬后再对组织进行修块，继续固定3～5小时。然后用0.1mol/L的磷酸缓冲液（PH7.2～7.4）清洗样品0.5～1小时，之后将样品放入25％和30％的甘油——生理盐水混合液中各处理4～6小时。

现在是8页\一共有21页\编辑于星期五

2、碳棒与铂珠的制备和组装：（1）、碳棒的预处理：取长约5～6cm，直径3mm的光谱纯碳棒4段（A、B、C、D），将A、B两段碳棒的一端磨成15度的斜角，C、D两段碳棒的一头磨成直径为1mm，长度约为5mm。（2）、缠绕铂丝：取直径0.1mm的铂丝8～12cm，缠绕到D碳棒磨细的一端的中间区。铂丝在碳棒上一定缠绕紧密，否则会在碳棒上烧成散在的小铂珠（见下图）。

现在是9页\一共有21页\编辑于星期五

碳棒的安装及其铂珠的烧结示意图现在是10页\一共有21页\编辑于星期五

（3）、碳棒的组装：先将HFZ－1型冷冻割断装置装好（如图）放入HUS－5GB真空喷镀仪的钟罩内的塑料底盘上，将“A”碳棒固定在钟罩内的一个固定电极上，碳棒的150斜面对准割断装置的一个孔道；“C”碳棒固定在对应的可动电极上，使其细端顶在A碳棒斜面的中间，这就是一对碳电极。然后，将“B”碳棒固定到另一个固定电极上，使150的斜面对准另一个孔道，“D”碳棒固定到“B”碳棒对应的活动电极上，使其细端对在“B”碳棒斜面的中间，这是铂电极。碳电极的喷发点与样品表面呈900角，铂电极的喷发点与样品表面呈450角，两个电极喷发点离样品表面为10～11cm。现在是11页\一共有21页\编辑于星期五HUS---5GB真空喷镀仪现在是12页\一共有21页\编辑于星期五

（4）、喷发点的调整：将两组电极安装好后，必须用三点一线的方法再细心校正，使喷发点分别对准两隔热板孔和喷碳与喷铂孔道的正中央。否则铂和碳可能喷不到样品的表面上。最后将碳棒可动侧的弹簧调节好，使得弹力大小要适当。如果太松加热后可能短路，碳棒尖端会离开斜面；太紧对应面碳棒的尖端会滑落而不能进行喷镀

。校准完毕将割断装置移出喷镀仪的钟罩。（5）、烧制铂珠：为了提高喷镀效果，要在喷镀前将碳棒上缠绕的铂丝在低真空（10－2～10－3讬）状态下溶化呈珠状。铂珠在碳棒磨细端的尖端，并将铂珠对准孔道，控制好真空度和加热电流是铂珠烧制的关键。

现在是13页\一共有21页\编辑于星期五

HFZ—1冷冻割断装置的组装示意图

现在是14页\一共有21页\编辑于星期五3、冷冻蚀刻复型装置的准备：在样品处理到冷冻开始之前，先将真空喷镀仪通电预抽真空。为保证割断装置的良好性能，每次使用之前必须认真进行擦拭，以除去水分、油污和氧化层，必要时可用抛光膏和丙酮进行表面清洗。认真接好FE－1加温控制器的线路并进行复查。将保温瓶装满冰水保持在00C。

4、安装样品：在冷冻开始前应将样品装入样品杯内，并加入少量的30％的甘油——生理盐水。样品应高出孔的表面1mm，样品杯内应充满，不能有空隙。现在是15页\一共有21页\编辑于星期五

5、安装割断刀和加热器：将专用的刀片安装到刀座上，刀刃要凹进滑面0.1mm，拧紧螺丝。将加热器固定在样品座底部，拧紧螺丝。

6、冷冻样品和割断装置：样品安装完并组装好割断装置，将割断装置放入盛有液氮的广口保温瓶内，并使割断装置被液氮浸没，待液氮停止沸腾，将有样品的样品杯放入液氮内冷冻，待液氮停止沸腾，从液氮中取出割断装置，快速把样品杯准确的放入样品座的杯槽内，再用安装棒将刀座推向样品座，使二者的斜面吻合。现在是16页\一共有21页\编辑于星期五

然后用运输提篮将安装好的割断装置放入液氮中冷冻至液氮停止沸腾，立刻用运载篮将割断装置移到HUS——5GB的真空罩内的塑料底座上，将支架块拉线挂在挡板的手柄上，接上温度控制器插头，盖好真空玻璃罩开始抽真空，同时向真空喷镀仪的冷阱内加满液氮。现在是17页\一共有21页\编辑于星期五

7、样品的断裂和蚀刻：当真空度达到1×10－5讬以上，样品的温度升至－1000～－1100C之间时是样品断裂的最佳时机，这是猛拉挡板手柄，刀座顺势沿斜面滑下并将样品割断。在样品被割断后升高温度至－1000～－900C时，在此温度下蚀刻15～19秒，蚀刻的速度为2nm／秒，蚀刻的深度约为300～400nm。

现在是18页\一共有21页\编辑于星期五

8、在样品表面喷镀碳和铂制作样品断面的复型：当蚀刻的时间到，先对铂电极通电使之加热，以与样品成450角向样品表面喷镀铂。当加上电流后开始碳棒尖端变红，随电流的增大在2～3秒内铂珠熔化、气化，当刚出现碳火花时即可停止通电。然后再使碳电极通电，以900角向样品表面喷镀碳来加固复型膜。喷碳采用间断喷镀法，每次喷碳时间约1秒，没隔3～4秒喷一次，共喷4～5次。现在是19页\一共有21页\编辑于星期五

样品被割断、蚀刻和喷镀过程示意图

现在是20页\一共有21页\编辑于星期五

9、复型膜的分离与清洗：喷镀结束后，把真空罩内恢复大气压，取出样品杯放入盛有蒸馏水的白色坩埚内，用针尖轻轻将杯中的样品挑于水中。然后用吸管将样品吸到另一个坩埚内，向样品上滴加少量70％的次氯酸钠水溶液，约0.5小时后复型膜逐渐与样品分离，漂