实验五质粒提取鉴定

实验五——质粒抽提与鉴定PlasmidExtractionandIdentification

吴旭日wxrhd@163.comxuriwu@实验目的

了解质粒(Plasmid)DNA微量快速提取的原理。

掌握质粒(Plasmid)DNA微量快速提取、纯化及鉴定方法。实验原理1.质粒(Plasmid)细菌细胞内独立存在于染色体之外的能自我复制和遗传的共价闭合环状双链DNA分子，大小从1kb到200kb不等，常被用作基因工程的载体。2.质粒载体(PlasmidVector)是经过人工改造后可以插入外源DNA片段并通过转化等方法将外源DNA导入工程细胞的质粒，可实现对外源目的基因的重组、筛选、扩增或表达。质粒载体的特点：(1)明显的选择标记(2)限制性位点(3)为非结合型质粒3.质粒抽提溶胞后核酸从胞内释放，利用质粒和染色体DNA

变性和复性特点上的差异将质粒和染色体DNA分

离开。在强碱性环境下氢键断裂，DNA双链解开成单链变性，随后用酸性缓冲液调至中性，变性质粒迅速复性，溶解于溶液环境中，而染色体DNA不能迅速复性，经离心可与其它不溶性大分子以沉淀方式除去。4.质粒纯化（1）酚抽提－沉淀法①酚∶氯仿∶异戊醇

(25∶24∶1）蛋白变性除脂类蛋白变性减少气泡②有机溶剂沉淀（乙醇、异丙醇等）水相有机相变性蛋白（2）层析法利用不同物质理化性质差异建立的分离方法。原理：在一定的离子环境下，核酸可被选择性地吸附到硅土、硅胶或玻璃等基质上而与其他生物分子分离。优点：质量好、产量高、成本低、快速、简便、省力、易于实现自动化等。（3）密度梯度离心法染料－CsCl密度梯度超离心紫外光石蜡油蛋白质ocDNA、线型DNA闭环质粒DNA超螺旋DNA5.质粒鉴定

(1)分子量鉴定

bp1M6000pET28a(+)(2)酶切鉴定1000750bpA)60003000bpM11M60003000pET28a(+)dkrB)(3)序列测定A：绿色；G：黄色；C：蓝色；T：红色6.琼脂糖凝胶电泳

用琼脂糖凝胶作支持物的电泳法。借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或分子形状不同，电泳移动速度有差异而分离。是基因操作中常用的重要方法。

不同形态DNA泳动速度：

共价闭合环状DNA＞开环DNA＞线性DNA实验步骤接含pET28a质粒的单菌落于3mlLB卡那霉素液体培养基中370C，200rpm振荡培养过夜取3ml菌液入EP离心管中12000rpm、离心1min，弃上清，收集菌体150μL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温5min加入250μL溶液II（轻轻混匀），室温静置5min裂解菌体加入200μL溶液III（轻轻混匀），冰上静置10min质粒DNA复性13000rpm，离心10min，取上清转移至质粒纯化层析柱内10000rpm，离心1min，弃去收集管中的滤液加入700μLbuffer70%乙醇，

13000rpm，离心1min，弃去收集管中的洗涤液，再将该步骤重复一次13000rpm，离心2min，甩干柱子中残余的液体层析柱装入新1.5mlEP管，加入50μLTE，室温静置5min，13000rpm，离心1min取10μL样品溶液，加入2μlloadingbuffer，90V恒压，琼脂糖凝胶电泳鉴定注意事项1.加入溶液Ⅱ后不可剧烈振荡，时间在5min以内。2.加入溶液Ⅲ后，复性时间不宜过长，一般5分钟。

3.转移上清时，避免带入沉淀。4.正确使用移液器，准确量取溶液。1.没有提出质粒或者质粒收获量很