流感相关知识与实验室检测

一、流感病毒的生物学特征流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性大流行，在动物中广泛分布，并也能在动物中引起流感流行和造成动物大量死亡。乙型流感病毒常引起流感局部暴发，不能引起世界性大流行，也没有在动物中存在的证据。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流行。第一页，共25页。第二页，共25页。流感病毒属于正粘病毒科，病毒颗粒多形态或球形，直径80～120nm，丝状体可达数微米。病毒的毒粒结构可分为三层：最外层为双层类脂囊膜，膜上覆盖着血凝素（H）、神经氨酸酶（N）、M2蛋白。囊膜上的突起，一种像三角形、细长的、能凝集红细胞的称血凝素（H），另一种像蘑菇样、能使病毒颗粒从吸附的红细胞表面释放下来的叫神经氨酸酶（N）。中间层为球形蛋白壳，是由基质（M1）蛋白形成的，有一个或若干个分子厚。里层为核壳体，呈螺旋对称，直径9～15nm，包含核蛋白（NP），三种多聚酶蛋白（PB1，PB2，PA），病毒单链的RNA.第三页，共25页。第四页，共25页。病毒是专性活细胞内寄生物，不能单独进行繁殖，必须在活细胞内才能繁殖。整个复制周期概括起来分为：吸附，侵入，脱壳，生物合成，装配与释放等5个步骤。第五页，共25页。第六页，共25页。流感在流行病学上最显著的特点为：突然爆发，迅速蔓延，波及面广，具有一定的季节性，发病率高，死亡率低，多发于青少年，一般不留后遗症，每次流行后在人群中总要造成不同程度的超额死亡，死亡者多为年迈体衰或有慢性疾病的患者。流感经呼吸道飞沫传播，潜伏期短，一般为1～3天。人对流感病毒普遍易感。病人是流感的主要传染源，隐性感染者因不易被人察觉，可自由活动，也易向周围人群传播病毒。第七页，共25页。一般来讲，流感病毒对热敏感，56℃30min被灭活。4℃～-40℃条件下不稳定，-70℃以下或冷冻干燥后置4℃可长期保存。流感病毒最适PH值7.0～8.0。流感病毒能被紫外线灭活，对乙醚、氯仿、丙酮等有机溶剂、氧化剂、卤素化合物、重金属、去污剂等均敏感。人流感病毒只感染呼吸道表面粘膜上皮细胞，并在这些细胞中繁殖。如果把活流感病毒注入易感者皮下或肌肉内，病毒不能繁殖，但可引起高热头痛、白细胞减少等症状。第八页，共25页。二、流感监测的意义流感为第一个实行全球性监测的传染病，目前已有80多个国家、110余个国家/地区流感中心组成了全球性流感监测网络。流感实验室监测最主要的目的是及时发现并抓到有意义的新变异株，尤其大流行株，提供给诊断试剂制备和疫苗生产；准备做好流感疫情预报。自人流感病毒被发现以来，人甲型流感病毒出现过四个亚型均首发于我国。1968年以来所出现的新变异株绝大多数也首发于我国。因此我国流感动态已引起WHO和世界各国的关注，甚至有人提示我国的南方是世界流感流行的中心。第九页，共25页。三、流感监测的方法流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异。长江以南地区，流感活动季节性不太强，每年有两个活动峰，一个在冬春季，另一个在夏季；长江以北地区具有较严格的季节性，每年只有一个冬春季高峰。在辽宁省，流感监测方案规定流行周每周至少采集10—15份，非流行周每周至少采集5—10份，流行季节（每年10月至次年3月）至少采集120份。第十页，共25页。流感样病例定义：体温≥38℃，伴有咳嗽或咽喉痛、全身痛等症状的急性呼吸道传染病病例。流感监测对象为发病三天之内的流感样病例，监测时采集的标本一般为咽拭子、鼻拭子或含漱液。当有流感暴发疫情时，应尽量收集典型病例的鼻咽拭子、含漱液、血清、抽吸液等标本。标本应在4℃保存24小时内送至实验室，实验室对收到的标本最好24～48小时内进行接种。第十一页，共25页。四、流感病毒实验室分离1、MDCK细胞传代技术2、流感病毒接种技术3、血凝实验第十二页，共25页。1、MDCK细胞传代技术把需用的溶液置室温或37℃恒温箱预温；把已长成片的MDCK细胞生长液倒掉；把Versene与0.25%胰酶按7：1～5：1的比例配制成消化液，每瓶细胞加入适量的消化液，置37℃恒温箱中消化，此期间要经常在倒置显微镜下观察。第十三页，共25页。当细胞变圆，细胞与细胞间互不相连，表明消化时间已到。倒掉消化液，每瓶加入适量的细胞生长液，用毛细吸管将细胞轻轻吹下吹散。加入适量细胞生长液，混匀。分装并留下原瓶。将分装好的细胞瓶放入37℃恒温箱中培养，约3～7天可长成片。长成片的细胞即可进行病毒接种。第十四页，共25页。第十五页，共25页。细胞培养中应注意的一些问题：1、消化时间过长。胰酶浓度过低或保存时间过长。2、细胞的保存问题。3、温度的问题。温度增加2—3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时之内死亡。低温对细胞影响小。4、污染的问题。预防和避免污染是细胞培养成功的关键。第十六页，共25页。污染的预防添加抗生素实验时使用的器具用品消毒灭菌操作者严格遵守操作规程定期更换实验室及生物安全柜的滤膜发生污染后对实验室进行彻底消毒第十七页，共25页。2、流感病毒接种技术接种前先将标本管内的棉签取出，用小镊子摘下棉签头，在管内反复挤压后弃去。向标本管内加入抗生素放4℃2小时。目的：抑制细菌生长。将长成片的细胞弃去细胞生长液，用Hank′s液洗2遍，加入标本0.5～1ml，放33～35℃恒温箱内2小时。目的：使病毒吸附在细胞上。第十八页，共25页。弃去标本液，用Hank′s液洗2遍，加入2倍于细胞生长液的病毒维持液，放33～35℃恒温箱内培养。目的：使病毒在细胞内繁殖。逐日观察细胞形态，当有75～100%的细胞发生病变即可收获病毒。细胞病变形态包括拉丝、脱落、圆缩等。7日仍未发生病变的视为阴性。盲传一代，仍为阴性的可报告为阴性。第十九页，共25页。第二十页，共25页。第二十一页，共25页。3、血凝实验第一孔加入100μl病毒液，其下各孔均加入50μl生理盐水；由第一孔开始做倍比稀释，最后一孔弃去50μl液体；每孔内加入50μl1%血球，混匀；室温静置30～60分钟观察结果。以生理盐水做阴性对照。第二十二页，共25页。血球均匀凝集