酶引论优秀公开课课件

第9章

酶引论Enzyme一、酶研究的简史约公元前21世纪夏禹时代,人们就会酿酒。公元前12世纪，周朝已能制作饴糖和用豆类做酱；1810年，GaylussacJ发现酵母可将糖转化为酒精；1878年，Kuhne给酶一个统一的名词,叫Enzyme,希腊文意思是“在酵母中”；1913年，Michaelis和Menten提出米氏方程，酶由定性到定量,奠定了酶学发展的里程碑；1926年Sumner从刀豆提取出脲酶并获得结晶,证明其为蛋白质，并提出酶的本质就是蛋白质的观点。奠定了现代酶学、蛋白质化学的基础。

萨姆纳,J.B.美国生物化学家,1946年获诺贝尔化学奖

80年代初Cech和Altman分别发现了核酶(ribozyme),开辟了酶学研究的新领域,1989年共同获得诺贝尔化学奖。

切赫T.R.Cech（1947－）奥尔特曼S.Altman(1939-)

1986年，Schultz与Lerner研制成功抗体酶；Boyer和Walker阐明ATP合酶合成与分解ATP的分子机制－1997获诺贝尔化学奖；近20年，飞速发展，许多酶机制被阐明，已鉴定4000多种酶，数百种得到结晶。酶的研究成果用于医学、农业、食品、制革、纺织、日化等部门，很大发展前途。二、

酶的概念及其作用特点1、酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。生物催化剂：酶(enzyme)核酶(ribozyme)

3、

酶催化反应的特点（1）催化效率高酶催化反应速度比非酶催化反应速度至少高出几个数量级。（2）高度专一性：酶对反应的底物和产物都有极高的专一性。

（3）易失活，反应条件大多要求温和：常温、常压，中性pH（4）酶活性可调节：根据据生物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成与降解等。二、

酶的化学本质及其组成（一）

酶的化学本质1982年，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学SidneyAltman各自独立发现RNA具有生物催化功能，此发现被认为是近年来生化领域最令人鼓舞的发现，此二人分亨1989诺贝尔化学奖。★核酶(ribozyme)：具有催化功能的RNA。

（二）

酶的化学组成单纯酶类(simpleenzyme)：仅由蛋白质组成，不含其它物质，如脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶等。缀合酶类（conjugatedenzyme)：全酶=脱辅酶+辅因子，二者存在时酶才有催化作用；如超氧化物歧化酶（Cu2＋、Zn2＋）、乳酸脱氢酶（NAD+）

辅酶：与酶蛋白结合较松，可透析除去。如NAD+

，NADP+

辅基：共价键，与酶蛋白结合较紧，透析不可除去。如细胞色素氧化酶的铁卟啉金属离子：Fe2+、

Zn2+、Cu+、Cu2+、Mn3+、Mg2+

、K+、Na+

、Co2+等。有机化合物：NAD+

，NADP+

，FAD，生物素，卟啉等酶的辅因子主要有金属离子和有机化合物，并且根据与脱辅酶结合的松紧程度不同可分为两类，即辅酶和辅基。（1）单体酶一般是由一条肽链组成，大多是催化水解反应的酶。鸡卵清溶菌酶129a.a单链

（三）酶的四级缔合

（3）多酶复合体由几个酶靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成：①丙酮酸脱氢酶（E1）以二聚体存在2×9600②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2）70000③二氢硫辛酸脱氢酶（E3）以二聚体存在2×56000复合体：

12个E1二聚体24×9600024个E2单体24×700006个E3二聚体12×56000总分子量：460万三、酶的命名和分类（一）习惯命名1.依据底物来命名（绝大多数酶）：蛋白酶、淀粉酶；2.依据催化反应的性质命名：水解酶、转氨酶；3结合上述两个原则命名：琥珀酸脱氢酶；4.有时加上酶的来源：胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶。（二）国际系统命名基本原则：明确标明酶的底物及催化反应的性质（底物为水时可略去不写）。举例：

谷丙转氨酶的系统名称：丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶

丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶乙醇脱氢酶EC1.1.1.1，乳酸脱氢酶EC1.1.1.27，苹果酸脱氢酶EC1.1.1.37第一个数字表示大类：氧化还原酶类第二个数字表示反应基团：醇基第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。前面三个编号表明这个酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。★酶的国际系统分类★1、2、3、4、5、6分别表示：氧、转、水、裂、异、合氧化-还原酶催化氧化-还原反应。主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。如，乳酸脱氢酶；乳酸：NAD+氧化还原酶（EC1.1.1.27）

催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化-还原酶Oxido－reductase水解酶催化底物的水解反应。主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。例如，脂肪酶(Lipase)催化的酯的水解反应：(3)水解酶hydrolase裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。例如，二磷酸酮糖裂合酶（EC4.1.2.7），习惯名：醛缩酶。(4)裂合酶Lyase（一）酶专一性类型1、结构专一性（1）绝对专一性酶对底物的要求非常严格，只能对某一种底物的某一种反应起催化作用。

脲酶只能催化尿素水解,而对尿素的各种衍生物或尿素的其它反应不起作用。麦芽糖酶只作用于麦芽糖。（2）相对专一性：对底物专一性降低，可作用一类结构相似的底物。

四、酶的专一性★基团专一性除了对键有要求，还对于键的一端的基团要求严格。例如：1.α-D-葡萄糖苷酶不但要求α-糖苷键,并且要求α-糖苷键的一端必须有葡萄糖残基,而对键的另一端基团则要求不严,因此它可催化含有α-葡萄糖苷的蔗糖或麦芽糖水解,但不能使含有β-葡萄糖苷的纤维二糖水解。2.

胰蛋白酶水解含有赖氨酰-或精氨酰-羰基肽键的物质。★键专一性：作用于具有相同化学键的一类底物,对键两端的基团并无严格要求。这类酶对底物结构的要求低。例如：酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解。

2.立体异构专一性

有些酶不仅对底物化学结构有要求,而且对底物分子的立体构型也有要求,称作立体异构专一性。立体异构专一性又分两类:(1)旋光异构专一性当底物具有旋光性时,酶只能作用于其中的一种。它是酶反应中相当普遍的现象。例如：

L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化,而对D-氨基酸无作用。(2)几何（顺反）异构专一性

酶对底物的几何构型有严格的要求称之为几何异构专一性。

例如：延胡索酸酶只能催化反丁烯二酸（即延胡索酸），而不能催化顺丁烯二酸的水合作用。（二）

酶作用专一性的解释1、锁钥模型(lock-keyhypothesis)

Fisher1894；酶活性中心的形状与底物分子形状互补。底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。锁钥模型较好地解释了立体异构专一性。但不能解释可逆反应。2、诱导契合模型(induced-fithypothesis)（Koshland1958年提出），酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补契合，进行反应。总之：酶与底物作用的专一性是酶与底物分子的结构互补，诱导契合，通过分子的相互识别而产生的。五、酶的活力测定（一）酶活力与酶促反应速度酶活力（enzymeactivity）：酶催化某一反应的能力，其大小可用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示（一般测初速度）。酶促反应速度：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量；单位：浓度/单位时间研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。因为底物浓度降低、酶部分失活、产物抑制和逆反应等因素，会使反应速度随反应时间的延长而下降。（二）酶的活力单位：表示酶活力大小所用的单位国际单位（IU单位）：在最适反应条件下，每分钟催化1μmol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU），1IU=1μmol/min。国际单位（Katal,Kat单位）：在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位1Kat＝60×106IU；1IU＝1/60μKat＝16.7nKat最适条件：最适温度,最适pH、最适缓冲液离子强度、最适底物浓度。底物浓度要求：（1）通常很大，使酶饱和；（2）底物消耗≤5%。（三）酶活力的测定酶活力的测定包括两个阶段：首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。六、酶分子工程

固定化酶是指将水溶性的酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的酶。反应后的酶可以回收重复使用。（一）固定化酶什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术固定化酶的优点①极易将固定化酶与底物、产物分开;②可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应;③在大多数情况下,能够提高酶的稳定性;④酶反应过程能够加以严格控制;⑤产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;⑥可以增加产物的收率,提高产物的质量;⑦酶的使用效率提高,成本降低。（二）酶的化学修饰（Chemicalmodification）

是指用化学手段将某些原子或化学基团结合到酶分子上，或将酶分子中某基团改变，从而达到改变酶的催化性质及一些生理生化性质的目的。酶的化学修饰广泛用于酶的作用机理研究，医药、农业、酶工程、生化工程等领域。化学修饰具有易实现，作用快，成本低等优点，是一项常用的重要技术。例如：1、用乙醛酸修饰胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成亲水性的α－NHCH2COOH后，该酶对60°C热处理的稳定性增高了1000倍。2、超氧化物歧化酶、尿酸酶等用PEG修饰后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，减慢了它们在动物血液循环中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％。（三）抗体酶(Abzyme)又称催化性抗体（catalyticantibody）。是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋白，在其可变区赋予了酶的属性。

抗体酶的制备方法

诱导法

以Pauling的稳定过渡态理论为指导，即酶的催化在于能结合底物产生过渡态，降低能障（反应的活化能）。以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互补构象的抗体，使其具有催化活性，可观察到抗体催化相应底物发生化学反应。

用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（如牛血清白蛋白）偶联制成抗原。然后对动物进行免疫，取免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交，杂交细胞分泌单克隆抗体，经筛选和纯化，得到抗体酶。例：Schultz研究小组以羧酸二酯水解反应的过渡态类似物对硝基苯磷酰胆碱作为半抗原，诱导产生单