生物制品2011课件

第18章生物制品第一节概述历史的灾难：传染病/战争传染病黑热病（腹股沟淋巴结炎性鼠疫）：公园前543~548年在康士坦丁堡，仅仅4个月就夺去20万人的生命。在1346年，近1/3的欧洲人死于这次大流行，20世纪初，黑死病大流行夺走了印度超过100万生命流感：1918.3-1919.1的10个月内，有5000万人死亡，人数多于第1次世界大战战亡人数（900万军人死亡、2000万人受伤、1000万人饿死病死）。战争一战：动员兵力7340万余人，参战部队2900万人，死于战场的约

1000万人，受伤约2000万人。二战：共有5700万人死亡。一免疫学发展简史

分3个阶段：经验免疫学时期（公元10世纪起—19世纪）科学免疫学时期（19世纪末—20世纪中叶）独立学科形成时期—《免疫学》诞生（20世纪60年代）—《现代免疫学》（20世纪90年代）

图1-1鼠疫流行的历史记载Fig1-1HistoricalReviewofthePlagueEpidemic经验免疫学阶段（16-19世纪）人痘苗——中国人16-17世纪1796年，英国人EdwardJenner发明牛痘苗预防天花（cowpoxvaccine）中国古代种痘图Variolation人们对疫苗的恐惧宝贝，接种疫苗啦！科学免疫学时期

（19世纪末-20世纪中叶）人工主动免疫（Artificalactiveimmunity）1880年，法国的LouisPasteur

减毒活疫苗技术（Live-attenuatedvaccine）鸡霍乱弧菌减毒疫苗预防炭疽、狂犬病的减毒疫苗。进入科学王国的最完美无缺的人人工被动免疫（passiveimmunity）1888年，Roux和Yersin—白喉的致病机制是由白喉杆菌外毒素所致1890年，德国学者Behring和日本学者北里(Kitasato）

—用白喉杆菌外毒素免疫马，然后用这种免疫血清，即抗毒素来治疗白喉，首先在人体获得成功

（2）免疫应答机制的研究细胞免疫（cellularimmunity）—俄国科学家梅契尼柯夫机体的免疫机制，主要就是以增强了吞噬功能的白细胞所发挥的吞噬作用体液免疫（humoralimmunity）

—Ehrlich等体液中产生了针对各种病原微生物的相应抗体,并发现在试管中这些抗体能与相应的病原体微生物发生凝集和沉淀等现象1903年，Wright及Douglas把细胞学说与体液学说统一起来

1903年Wright及Douglas仔细观察了Metchnikoff提出的吞噬作用(phagocytosis)，并证明相应的抗体能增强吞噬细胞对相应细菌的吞噬，这种抗体被称为调理素(opsonin)，从此把细胞学说与体液学说统一起来

Burnet克隆选择学说1960，F.M.Burnet体内存在着无数抗原特异性（TCR、BCR）淋巴细胞克隆。胚胎期与自身成分反应的T、B淋巴细胞被“禁忌”，形成免疫耐受。出生后淋巴细胞遇到相应抗原而被选择发生特异应答，产生抗体或致敏淋巴细胞，并形成记忆（Tm、Bm）。“禁忌”细胞突变，可导致自身免疫。(3)抗体形成机制(4)免疫病理概念的形成免疫病理:指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病。

过敏反应（anaphylaxis）—20世纪初，Richet和Portier移植排斥（graftrejection）

（1）抗原与抗原表位

antigen&Epitope（20纪，KarLandsteiner)（2)抗体的研究抗体与丙种球蛋白：1938年，Tiselius等抗体是由浆细胞产生：1949年，Astrid等抗体的基本化学结构：20世纪50年代，Porter和Edelman抗体的基因结构：20世纪70年代，利根川进(3)免疫遗传学研究MHC（主要组织相容性复合体）抗体多样性抗体多样性遗传控制(geneticcontrolofantibodydiversity)1978年，Tonegawa:克隆了Ig的V、C区基因，使免疫学进入分子免疫学（molecularimmunology）

(4)免疫学理论体系的形成①克隆选择学说（clonalselectiontheory）②免疫耐受机制研究(researchofimmunetolerancemechanisms)③免疫应答机制研究(researchofimmuneresponsemechanisms)④早期的细胞免疫与体液免疫学说(cellularimmunityandhumoralimmunitytheoryatearlystage)⑤免疫应答分子机制的阐明（elucidationofmolecularmechanismsofimmuneresponse）根据用途又可将生物制品分为预防类、治疗类和诊断类三大类制品。预防类治疗类制品诊断类制品三、生物制品的分类1、预防类制品此类制品主要用于感染性疾病的预防。常用的有如下几种疫苗类毒素

由有关细菌产生的外毒素经脱毒后制成的。常用的有白喉、破伤风、肉毒类毒素及葡萄球菌类毒素等混合制剂常用的混合制剂的有以下几种。联合细菌伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗，霍乱、伤寒、副伤寒甲、乙联合菌苗。联合病毒麻疹、牛痘苗联合疫苗，麻疹、风疹联合疫苗，风疹、腮腺炎联合疫苗，麻疹、腮腺炎风疹联合疫苗。细菌和类毒素混合制剂白喉毒素类、百日咳菌苗和破伤风类毒素混合制剂细胞因子许多细胞因子也具有明显的免疫佐剂效用，能增强特异抗原的免疫原性或增强机体对抗原的反应性，这些细胞因子包括IL-1、IL-2、IFN-7、IL-6等。作用主要表现在以下两个方面：增强机体的抗感染能力，增强疫苗的保护效应，研究表明，在注射抗原的同时或预先注射细胞因子，可明显增强针对该抗原的免疫应答能力。3.诊断类制品体内诊断用品用于皮内接种，以判断个体对病原的易感性或免疫状态。如锡克毒素和结核菌素等。体外诊断用品生物制品除体外诊断用品外，其他均直接应用于人体，故各国及世界卫生组织对其质量均有严格要求。四、生物制品的免疫学基础1、机体的抗感染免疫机体的抗感染免疫传统上分为先天性免疫和获得性免疫两大类。免疫类型作用途径实例先天性（非特异性免疫）主动免疫体表屏障，血脑屏障，血肽屏障，细胞吞噬作用，正常体液和组织中抗菌物质获得性（特异性）免疫主动免疫自然（形成）：感染人工（诱导）：类毒素、死或活菌（疫）前注射自然：母体抗体通过胎盘（IgG）或初乳（IgA）输给被动免疫婴儿人工：同种或异种抗体注射2、人工免疫人为地给机体输入抗原以调动机体的免疫系统，或直接输入免疫血清，使其获得某种特殊抵抗力，用以预防或治疗某些疾病者，称为人工免疫（ariticialimmunization）。人工免疫用于预防传染病时，常称预防接种，它是增强人体特异免疫力的重要方法。（1）人工主动免疫

人工自动免疫（artificialactiveimmunization）是给机体输入抗原物质，使免疫系统因抗原刺激而产生类似感染时所发生的免疫过程，从而产生特异性免疫力。这种免疫力出现较慢，常有1-4周诱导期，但维持较久，可从半年到数年。用于人工自动免疫的抗原性制剂，大部分由病原微生物直接制成，称为疫苗；取微生物毒素去毒而制成，称为类毒素。（2）人工被动免疫

人工被动免疫(artificialpassiveimmunization)是人为将抗毒素、正常人免疫球蛋白等现成免疫效应物质输入机体，使机体立即获得特异性免疫力以达到某些疾病防治的目的。维持时间常较短暂（2~3周），多用于治疗或紧急预防传染病。3.机体免疫的机制人类免疫系统主要分为两大类，即体液免疫和细胞免疫体液免疫也就是通过形成抗体而产生的免疫能力；抗体是由血液和体液中的B细胞产生，主要存在于体液中，它可与入侵的外来抗原物质相结合，使其失活。细胞免疫是指主要由各种淋巴细胞来执行的免疫功能。抗原抗原肽细胞表面复合物活化的B细胞(浆细胞)淋巴因子活化的T细胞抗体杀灭抗原分子抗原显示细胞(如树状细胞)吞噬、分解MHC蛋白质(组织匹配性抗原)识别、激活杀伤性T细胞分泌激活释放激活释放图10-1人体免疫系统工作机制示意图第二节疫苗一、疫苗的定义一切通过注射或黏膜途径接种，可以诱导机体产生针对特定致病原的特异性抗体或细胞免疫，从而使机体获得保护或消灭该致病原能力的生物制品统称为疫苗，包括蛋白质，多糖，核酸，活载体或感染因子。分为细菌类及其类毒素类疫苗，病毒类疫苗，蛋白疫苗及核酸疫苗。第一代疫苗灭活疫苗（也称死疫苗）指的是用物理或化学方法将病原微生物杀死或灭活后制备的生物制品，如霍乱菌苗和百日咳菌苗等。必须多次接种，且注射量较大减毒活疫苗是用人工筛选或诱导变异的方法制备的使毒力高度减弱或基本无毒的活生物制品，如结核菌苗和痢疾活菌苗等。注射量少，维持时间长，只需接种一次。第二代疫苗亚单位疫苗指的是提取病原微生物体内能刺激机体产生保护性免疫的有效抗原成分制备的疫苗合成肽疫苗依据有效免疫原性肽段的氨基酸序列设计与合成免疫原性多肽基因工程疫苗将编码免疫原的基因进行克隆，修饰和改造并借助载体转移至另一生物体基因组中，使之表达并产生所需抗原肽而制成的疫苗这类疫苗以其成分单一、效果明确、无致病作用为特点、但其工艺复杂、价格昂贵等问题限制了应用的范围。亚基疫苗（subunitvaccine）概念：利用病原体的某一部分通过基因工程克隆而制得的疫苗称为亚基疫苗。原理：对于致病性病毒而言，单纯的外壳结合蛋白即可在受体内激发生成足够多的抗体。优点：避免了直接使用病原物而使接受者可能致病的危险亚基疫苗和用纯的蛋白质作为免疫原，可以避免由于外源蛋白、核酸的混杂而造成的种种副作用，使得这种疫苗具有更高的安全性有时因单独使用特异蛋白能增强疫苗的效果局限性：纯化单一蛋白成本很高纯化后的蛋白的构象与在病原体体内时可能不同，从而导致抗原性发生变化。由于亚基疫苗一般不具有感染性，很难激活杀伤性T细胞，即只能激活机体的体液免疫，因不能同时调动细胞免疫，激活的免疫反应一般较弱。活体重组疫苗通过基因工程的方法，对非致病性微生物（细菌和病毒）进行改造，使之携带并表达某种特定病原体的抗原决定簇基因，产生免疫原性；或通过基因工程的方法修饰或删除致病性微生物的毒性基因，使之仍保持免疫原性所制成的疫苗。在这种疫苗中抗原决定簇的构象与致病性病原体的抗原的构象相同或非常相似，克服了亚基疫苗在纯化时，因蛋白质构象的改变而导致的抗原的变化和单一抗原只能诱发较弱的免疫应答的缺点。第三代疫苗DNA疫苗（也称基因疫苗或核酸疫苗），是用编码有效免疫原的基因重组体，直接接种，使机体表达保护性抗原，并建立特异性免疫。如流感病毒核蛋白DNA疫苗近年发展起来的用表达特定抗原蛋白的核酸制成的核酸疫苗，因具有高效、持久、广谱、简便、稳定、廉价、无致病性等特点发展得十分迅速、在短短几年时间，就有7种核酸疫苗（HIV、HBV、单纯保证病毒、流感病毒、结核病毒、疟原虫、T细胞淋巴瘤）经FDA批准进入临床试验。核酸疫苗核酸疫苗就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因的在生物体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗优势诱导机体产生全面的免疫应答（体液和细胞介导的免疫反应），其保护性免疫应答对不同亚型的病原体具有交叉抵御作用；无潜在致病作用，具有可靠地安全性；能表达经修饰的天然抗原，具有与天然抗原相同的构象和抗原性稳定性好、易纯化、易保藏、可大规模生产、成本低；可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，或将不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗；既有预防作用也有治疗作用。二、病毒类疫苗制造方法不同疫苗的制备工艺各异，但主要程序相似，图为一般疫苗的制备流程。毒株毒种纯化病毒悬液原苗原料感染动物已感染组织灭活疫苗含病毒悬液动物或胚胎健康动物(或胚胎)组织生长细胞细胞悬液原苗活疫苗配制培养基灭活原苗灭活疫苗检定稀释检定研磨悬浮解剖感染接种稀释检定稀释检定剪碎消化培养洗涤培养收获灭活检疫图10-2病毒类疫苗的一般制备工艺流程1.毒种的选择和减毒毒种必须有特异的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，这种免疫力足以阻止有关的病原体的侵入和防止机体发生相应的疾病。毒种应有典型的形态和感染特定组织的特性，并在传代的过程中，能长期保持生物学特性毒种易在特定的组织中大量繁殖毒种在人工繁殖的过程中，不应产生神经毒素或能引起机体损害的其他毒素。如为制备活疫苗，毒种在人工繁殖的过程中应无恢复原致病力的现象，以免在疫苗的使用时，机体发生相应的疾病毒株在分离时和形成毒种的全过程中应不被其他病毒所污染，并需要保持历史记录用于制备活疫苗的毒种，往往需要在特定的条件下将毒株经过长达数十次或上百次传代，降低其毒力，直至无临床致病性，才能用于生产。2.病毒的繁殖所有动物病毒，只能在活细胞中繁殖。活体动物培养鸡胚培养组织培养细胞培养活体动物培养（在生产中已逐渐被淘汰）将病毒接种动物的鼻腔，腹腔，脑腔或皮下，使之在相应的细胞内繁殖。缺点：是动物饲养管理麻烦和具有潜在病毒传播的危险鸡胚培养将病毒接种到7~14日龄鸡胚和尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等处，接种的部分亦因病毒种类的不同各异。成本大，不宜于大规模使用黏病毒（如流感病毒、麻疹病毒等）和痘病毒（如牛痘病毒等）外，其他病毒已很少用鸡胚进行培养。组织培养（广泛用于病毒培养）目前，差不多所有人类和动物的组织都能在试管中培养。基本方法如下：无菌操作取出目的组织，以培养液漂洗。以锋利无菌刀具割舍多余部分，将该组织分切成1~2mm小块，移入培养瓶。加入合适的培养基浸润组织。小心地将培养瓶平翻180°，搁置15~30min，以利组织块的贴壁生长。翻回培养瓶，平卧静置37℃培养。细胞培养用于疫苗生产的主要有原代细胞培养（将动物组织进行一次培养而不再传代）和传代细胞培养（长期传代的细胞株）两种方法细胞培养培养动物细胞的一般步骤：无菌取出目的细胞所在组织，以培养液漂洗干净。以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块。将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙离子和镁离子低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养。大量培养哺乳动物细胞步骤：（1）微导管培养法（2）微载体培养法（3）微胶囊培养法细胞培养时主要控制以下内容：1.常用的维持液和生长液2.培养条件的控制：pH值的控制7.0±0.2，培养基中的磷酸盐和碳酸氢钠有助于保持pH值的稳定。CO2的提供CO2分压保持在5%左右氧的提供用通气、摇瓶或转瓶培养的方法培养容器内壁洁净度的控制合成洗涤剂可以用来取代硫酸——铬酸混合液细菌污染的控制灭菌、抗生素培养温度和时间的控制37℃、一般为2~4天，大多为3天灭活组织细胞悬液消化病毒稀释液生长细胞原苗健康动物灭活原苗稀释鉴定分装稀释鉴定分装活疫苗灭活疫苗轧盖贴标签质检3.疫苗的灭活不同的疫苗，其灭活的方法不同，有的用甲醛溶液（如乙型脑炎疫苗,脊髓灰质炎灭活疫苗和斑疹伤寒疫苗等），有的则用酚溶液（如狂犬疫苗）所用灭活剂浓度则与疫苗中所含的动物组织量有关。灭活温度和时间，需视病毒的生物学性质和热稳定性质而定。有的可于37度灭活12d（如脊髓灰质炎灭活疫苗），有的仅需18～20度下灭活3d（如斑疹伤寒疫苗）4.疫苗的纯化疫苗纯化的目的，是去除存在的动物组织，降低疫苗接种后可能引起的不良反应。用细胞培养所获得的疫苗，动物组织量少，一般不需要特殊的纯化。但在细胞培养的过程中，需用换液的方法除去培养基中的牛血清（无血清培养液的使用）5.冻干疫苗的稳定性较差，一般在2～8℃下能保存12个月，但当温度升高后，效力很快降低。冻干的要点是：先将疫苗冷冻至共融点以下，在真空状态下降水分直接由固态升华为气态，然后缓慢升温，不使疫苗在任何时间下有融解情况发生，直至完全干燥，冻干的疫苗在真空或充氮后密封保存，使其残余水分保持3%以下。这样的疫苗将能保持良好的稳定性。三、细菌类疫苗和类毒素类的一般制造方法一般细菌类疫苗和类毒素制备的工艺流程如图减毒菌种病原菌菌株培养基菌种蛋白胨、肉浸液等原料培养毒素活疫苗菌苗原液菌液分离吸附精制类毒素精制类毒素类毒素稀释检定死菌菌苗死菌原液稀释检定杀菌过滤配制灭菌减毒检定Al(OH)3吸附检定纯化脱毒图10-3菌苗和类毒素的一般制备工艺流程1.菌种的选择用于菌苗的菌种，一般须具备以下几个条件菌种必须持有特定的抗原性，能使机体诱发特定的免疫力，阻止有关病原体的入侵或防止机体发生相应的疾病。菌种应具有典型的形态，培养特性和生化特性，并在传代的过程中，能长期保持这些特性。菌种应易于在人工培养基上培养。如系制备死菌苗，菌种在培养过程中应产生较小的毒性。如系制备活菌苗，菌种在培养过程中应无恢复原毒性的现象，以免在使用时，机体发生相应的疾病如系制备毒素，则菌种在培养的过程中应能产生大量的典型毒素。2.培养基的营养要求除碳源，氮源和各种无机盐类等培养微生物所需要的一般营养要素外，由于某些微生物生理上的特殊性，往往需要某些特殊营养物(如生长因子，某种氨基酸等)才能生长。3.培养条件的控制（1）氧分压各种细菌（需氧菌，厌氧菌和兼性厌氧菌）在生长时对氧量的要求不同。（2）温度最适培养温度，大都接近人体正常温度（35～37℃）（3）pH值pH值不同，细菌的代谢可能不同，这是由于抑制或增进了细菌的某些酶的活性引起（4）光培养不应在阳光或X射线下进行，以防止核糖核酸分子的变异，从而改变细菌的生物学特性（5）渗透压一般细菌的细胞壁较坚固，能在低渗环境下生存，在高渗透压环境下细菌收缩而死亡。4.杀菌只有死菌疫苗制剂在制成原液后需要用物理或化学方法杀菌，而活菌苗不必经过此步骤。各种菌苗所用的杀菌方法不相同，但杀菌的总目标是彻底杀死细菌而又不影响菌苗的防病效力以伤寒菌苗为例，可用加热杀菌法，甲醛溶液杀菌，丙酮杀菌等方法杀死伤寒杆菌5稀释，分装和冻干经杀菌的菌液，一般用含防腐剂的缓冲生理盐水稀释至所需的浓度,然后在无菌条件下分装于适当的容器。封口后在2～10℃保存，直至使用。有些菌苗，特别是活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥，以延长它们的有效期。5.稀释，分装和冻干经杀菌的菌液含防腐剂的缓冲生理盐水稀释浓度无菌条件下分装封口活菌苗，亦可于分装后冷冻干燥（2～10℃保存）第三节生物制品质量要求与检定一、生物制品的质量要求生物制品必须具备两个重要条件，即安全和有效。（WHO）要求各国生产的制品必须有专门检定机构负责成品的质量检定，并规定检定部门要有熟练的高级技术人员，精良的设备条件，以保证检定工作的质量。未经指定检定部门正式发给检定合格证的制品，不准出厂使用。生物制品的质量检定包括安全性和效力检定两方面。安全性包括毒性试验，防腐剂试验，热原质试验，安全试验，有关安全性的特殊试验等5项；效力检定包括浓度测定（含菌数或纯化抗原量），活菌率或病毒滴度测定，动物保护率试验，免疫抗体滴度测定，稳定性试验等5项二、生物制品的质量检定（一）理化性质检定（二）安全试验（三）效力试验（一）理化性质检定物理性状的检查（1）外观（2）真空度及溶解速度（3）装量蛋白质含量测定纯度检查及鉴定试验相对分子质量或分子大小测定防腐剂含量测定1.物理性状的检查（1）外观

通过特定的人工光源进行目测，对外观类型不同的制品，有不同的要求标准。（2）真空度及溶解速度真空封口的冻干制品，应通过高频火花真空测定器测定真空度，瓶内应出现蓝紫色辉光。另外，取一定量冻干制品，按规程要求，加适量溶剂，其溶解速度应在规定时限以下。（3）装量各种装量规格的制品，应通过容量法测试，其实际装量不得少于标示量（粘瓶量除外）2.蛋白质含量测定目的：检查其有效成分或蛋白杂志是否符合规程要求。根据蛋白质含量，还可以计算出抗毒素的纯度（U/g蛋白）方法：凯氏定氮法，双缩脲法，酚试剂法（Lowry法），紫外吸收法3.纯度检查及鉴别试验血液制品，抗毒素和类毒素等制品，需要进行纯度检查或做鉴别试验.方法；区带电泳，免疫电泳，凝胶层析，超速离心等技术进行分析4.相对分子质量或分子大小测定对提纯的蛋白质制品如白蛋白，丙种球蛋白或抗毒素，在必要时需测定其单体，聚合体或裂解片段的相对分子质量及分子的大小；提纯的多糖体疫苗需测定多糖体的分子大小及相对含量。方法：凝胶层析法；SDS法；超速离心分析法5.防腐剂含量测定生物制品在制造过程中，为了脱毒，灭活或防止杂菌污染，常加入苯酚，甲醛，氯仿，硫柳汞等试剂作为防腐剂或灭活剂。防腐剂的含量过高能引起制品有效成分的破坏，注射时也易引起疼痛等不良反应。各种防腐剂的含量都要求按《生物制品质量检定规程》控制在一定的限度以下（二）安全试验一、毒种或主要原材料的检查用于菌疫苗生产的菌毒种，除按有关规定严格管理外，投产前必须按《中国药典》的规定，进行毒力，特异性，培养特性等安全性试验；保证投产的血液制品不含病源物质二、半成品（包括原液）的检查检查对活菌，活毒或毒素的处理，如杀菌，灭活和脱毒是否完善，是否有污染，灭活剂和防腐剂是否过量等三、成品检查制品在分装或冻干后，必须进行出厂前的最后安全检查。按制品的各项不同要求，进行无菌试验，纯菌试验，毒性试验，过敏性试验，热原质试验及安全试验（指某制品的单项试验）等安全试验包括以下四个方面的内容1.外源性污染的检查除无菌与纯菌试验外，还需进行以下项目的检查。（1）野毒检查可能通过培养病毒的细胞（如鸡胚细胞，地鼠肾细胞和猴肾细胞等）带入有害的潜在病毒，这种外来病毒亦可在培养过程中繁殖，使制品污染，故应进行野毒检查。（2）热原质试验血液制品，抗毒素，多糖菌苗等制品，其原材料或在制造过程中，有可能被细菌或其他物质污染并带入制品，引起机体的致热反应。以家兔试验法作为检查热原的基准方法，对产品进行热原质检查。家兔法为各国药典收载的方法，属于体内检查法。该法检查热原的原理是基于家兔对热原的反应与人是相同的。系将一定剂量的供试品静脉注入家兔体内，然后在规定时间内测定家兔体温升高情况以判断供试品所含热原限度是否符合规定。具体方法及结果判断标准参看《中国药典》2000年版二部附录。鲎（hÒu）试验法鉴于家兔法费时较长，操作繁琐，近年来发展了体外热原试验法即鲎试验法，其原理是利用鲎试剂与细菌内毒素产生的胶凝反应来判断细菌内毒素的限量是否符合规定。鲎试剂来源于鲎（limuspolyphemus）血液的变形细胞溶解物(amebecytelysate)，其含有凝固酶原、凝固蛋白原及钙离子。胶凝反应如下：

（3）乙型肝炎表面抗原（HBsAg）检查血液制品除了对原材料（献血员血液，胎盘血液）要严格进行HBsAg检查外，对成品亦应进行该项检查2杀菌，灭活和脱毒检查方法：常用甲醛溶液或苯酚作为杀菌剂或灭活剂（1）无菌试验基本与检查外源性杂菌方法相同。目的主要是检查有无生产菌（毒）种生长，先用液体培养基进行稀释和增殖再进行移种致适于本菌生长的培养基。（2）活毒检查主要是检查灭活疫苗。须用对原毒株敏感的动物进行试验，一般多用小白鼠。（病毒，细菌（3）解毒试验主要用于检查类毒素等需要脱毒的制品。须用敏感的动物检查。3.残余毒力和毒性物质的检查（1）残余毒力检查所谓残余毒力是指生产这类制品的毒种本身是活的减毒（弱毒）株，允许有一定的轻微毒力存在，并能在接种动物机体后反映出来。此项测定目的是控制活疫苗的残余毒力在规定范围。（2）无毒性检查（一般安全试验）一般制品在没有明确规定的动物安全试验项目时，或不明了某制品是否会有何种不安全因素时，常采用较大剂量给小鼠或豚鼠作皮下或腹腔注射，观察动物有无不良反应。（3）毒性检查死菌苗,组织培养疫苗或白蛋白等制品，经杀菌，灭活，提纯等制造工艺后，其本身所含的某种成分可能仍具有毒性，当注射一定量时，可引起机体的有害反应，严重的可使动物死亡。故对此类制品的毒性反应必须试验。（4）防腐剂检查除活菌苗，活疫苗及输注用血液制品外，其他凡加有一定量防腐剂的制品，除用化学方法作定量测定外，还应作动物试验。含有苯酚防腐剂者，采用小白鼠试验，观察注射后的颤栗程度及局部反应。以便控制产品中防腐剂的含量。4.过敏性物质的检查（1）过敏性试验（变态反应试验）采用异体蛋白为原料制成的治疗制剂如治疗血清，代人血浆等，需检查其中过敏原的去除是否达到允许限度。一般用豚鼠进行试验。（2）牛血含量的测定主要用于检查组织培养疫苗（如乙型脑炎疫苗，麻疹疫苗，狂犬病疫苗），要求其含量不超过1ug/ml。由于牛血清是一种异体蛋白，如制品中残留量偏高，多次使用能引起机体变态反应，故应进行监测。测定方法一般采用间接血球凝集抑制试验或反向血球凝集试验（3）血型物质的检测用人胎盘血或静脉血制备的白蛋白和丙种球蛋白，常有少量的A或B血型物质，可使受试者产生高滴度的抗A，抗B抗体，O型血孕妇使用后，可能引起新生儿溶血症。因此，对这类制品应检测血型物质，并应规定其限量。（抗抗体：）（三）效力试验1.免疫力试验（1）定量免疫定量攻击法（2）变量免疫定量攻击法（3）定量免疫变量攻击法2.活菌数和活病毒滴度测定（1）活菌数（率）测定（2）活病毒滴度测定3.类毒素和抗毒素的单位测定（1）絮状单位（L1）测定（2）结合单位（BU）测（3）抗毒素单位测定4.血清学试验5.其他有关效力的检定和评价（1）鉴别试验（2）稳定性试验（3）人体效果观察人体皮肤反应观察血清学效果观察流行病学效果观察（三）效力试验生物制品的效力：1、指制品中有效成分的含量水平2、指制品在机体中建立自动免疫或被动免疫后所引起的抗感染作用的能力诊断用品，其效力则表现在诊断试验的特异性和敏感性。效力试验包括以下五个方面的内容：1、免疫力试验将制品对动物进行自动（或被动）免疫后，用活菌、活毒或毒素攻击，从而判定制品的保护力强弱。（1）定量免疫定量攻击法用豚鼠或小鼠，先以定量制品（抗原）免疫2-5周后，再以相应的定量[最小致死量（MLD）或最小感染量（MID）毒种或毒素攻击，观察动物的存活数或不受感染的情况，以判定制品的效力]（2）变量免疫定量攻击法即50%有效免疫剂量（effectivedoseED50，infectiousdoseID50）测定法。疫苗经系列稀释，制成不同的免疫剂量，分别免疫各组动物，间隔一定日期后，各免疫组均用同一剂量的毒种攻击，观察一定时间，用统计学方法计算出能使50%的动物获得保护的免疫剂量。此法多用小白鼠进行，其优点是较为敏感和简便。（3）定量免疫变量攻击法即保护指数（免疫指数）测定法。动物经制品免疫后，其耐受毒种的攻击量相当于未免疫动物耐受量的倍数，称为保护指数。此法常用于死疫苗及灭活疫苗的效力检定。（4）被动保护力测定先用其他免疫机体（如人体）获得某制品的相应抗血清，用以注射动物，待一至数日后，用相应的毒种攻击，观察血清抗体的被动免疫所引起的保护作用2、活菌数和活病毒滴度测定（1）活菌数（率）测定卡介苗、鼠疫活菌苗、布氏菌病活菌苗、炭疽活菌苗等多以制品中抗原菌的活存数（率）表示其效力。比浊法稀释平板计数，10倍或2倍系列稀释测定含菌浓度计算活菌率（2）活病毒滴度测定活疫苗（如麻疹疫苗、流感活疫苗）多以病毒滴度表示其效力。病毒滴度也即病毒的毒力，或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)和半数致死量(LD50)，其中以LD50最常用。常用组织培养法或鸡胚感染法测定3、类毒素和抗毒素的单位测定（1）絮状单位（L1）测定能和一个单位抗毒素发生絮状沉淀反应的（类）毒素量，即为一个絮状单位。此单位数常用以表示类毒素或毒素的效价。（2）结合单位（BU）测定能与0.01单位抗毒素中和的最小类毒素量称为一个结合单位。常用以表示破伤风类毒素的效价。用中和法通过小鼠测定。（3）抗毒素单位测定目前国际上都用“国际单位”（IU）代表抗毒素的效价概念：当与一个致死限量的毒素作用后，再注射动物（小白鼠、豚鼠或家兔），仍能使该动物在一定时间内（96h左右）死亡或呈现一定反应所需要的最小抗毒素量，即为一个抗毒素国际单位。常用中和法测定。4、血清学试验主要用来测定抗体水平或抗原活性。预防制品接种机体后，可产生相应抗体，并可保持较长时间。常用以血清学方法检查抗体或抗原活性，并多在体外进行试验。包括沉淀试验、凝集试验、间接血凝试验、间接血凝抑制试验、反向血凝试验、补体结合试验及中和试验等。5、其他有关效力的检定和评价（1）鉴别试验亦称同质性（identity）试验。一般采用已知特异血清（国家检定机构发给的标准血清或参考血清）和适宜方法对制品进行特异性鉴别。（2）稳定性试验制品的质量水平，不仅表现在出厂时效力检定结果，而且还表现于效力稳定性。因而需对产品进行稳定性测定和考察。一般方法是将制品放置不同温度（2~10℃,25℃,37℃），观察不同时间（1周，2周，3周….;1月，2月，3月….）的效力下降情况。（3）人体效果观察有些用于人体的制品，特别是新制品，仅有实验室检定结果是不够的，必须进行人体效果观察，以考核和证实制品的实际质量。观察方法常有以下几种。人体皮肤反应观察一般在接种制品的一定时间后（1月以上），再于皮内注射反应原，观察24-48h的局部反应，以出现红肿、浸润或硬结反应为阳性，表示接种成功。阳转率的高低反映制品的免疫效果，也是细胞免疫功能的表现。血清学效果观察将制品接种人体后，定期采血检测抗体水平，并可连续观察抗体的动态变化，以评价制品的免疫效果和持久性。它反映接种后的体液免疫状况。流行病学效果观察在传染病流行期的疫区现场，考核制品接种后的流行病学效果；三、生物制品检定标准品由于试验动物的个体差异，所用试剂或原材料的纯度或敏感性不一致等原因，往往导致同一批制品的检定结果也往往相互悬殊。用一已知效力的制品作为对照，由对照结果来校正检定试验结果。这种用作对照的制品，就是生物标准，也就是通常所说的标准品或参考品生物制品的标准品或参考品，必须由世界卫生组织或国家检定机构审定分发。如果是由世界卫生组织审定发出的，就称为国际标准；如果是国家检定机构批准发出的，则称为国家标准。1.生物制品标准品的要求：（1）要求准确（2）要求冻干（3）要求熔封（4）要有瓶签、说明书和实验数据2.标准品的分级（1）国际生物标准（2）国际参考制品（3）国际生物参考试剂一、卡介苗疫苗病原菌是结合分歧杆菌。卡介苗是Nocard1902年从牛体分离的一株牛型结核杆菌。如果向培养这株结合杆菌的甘油土豆培养基中加入牛胆汁，则菌种逐步缓慢丧失其毒力。Calmette和Guerin二人从1906年开始采用这个方法，约每2~3星期传代一次，前后共传了231代，经约13年时间，获得一株稳定的减毒株。第三节重要的疫苗制备工艺牛型结核杆菌减毒株改良的苏通培养基37~39℃10~12天收集幼龄培养物菌膜盛有不锈钢珠瓶内适量稀释液低温下研磨原液稀释分装菌苗卡介苗表面培养流程图苏通培养基在100ml蒸馏水中加入：

天门冬素-0.4g

枸橼酸盐-0.2g

磷酸氢二钾-0.05g

MgSO4.7H2O-0.05g

枸橼酸铁铵-0.05g

甘油-6ml

补加蒸馏水到100ml

用氨水调节pH7.27.4二、白喉疫苗1923年Romon向白喉毒素内加入0.3%~0.4%甲醛，放置38℃,4周后，其毒性消失，但能使动物产生免疫力，从而制得白喉毒素的类毒素。干燥菌种全培养液产毒培养液沉淀精制毒素滤液精制类毒素吸附精制类毒素种子传代保浦氏培养基或其他适宜培养基34-35℃，48-54h培养0.15%甲醛(NH4)2SO4二段沉淀法分离精制保浦氏培养基或其他适宜培养基34-35℃，50h左右脱毒0.2%甲醛，室温2-3d0.3%甲醛，36-37℃，35dAlPO4或Al(OH3)吸附溶解，透析，除菌过滤图10-4吸附精制白喉类毒素的工艺流程（1）菌种

采用产高效价毒素的菌株（Pw8）培养基：改良马丁培养基：主要成分为猪胃消化液及牛肉水，将猪胃消化液继续用胰酶消化，提高其氨基氮含量，菌种产毒能力得到很大提高保浦市培养基：胰酶消化牛肉后煮沸过滤形成的消化液，再加入酵母浸液、乳酸、氯化钙等成分构成。改良林氏培养基：由Linggood原制培养基改良而成。（2）培养产毒a.产毒培养基用保浦氏培养基。在培养过程中必需加入细菌必需的氨基酸、糖类、各种生长因子及无机离子。b.培养采用深层培养法，以利于细菌生长过程中能源的补充、供氧量的调节及pH的控制，更好发挥细菌产毒的能力。温度控制在34~35℃，pH值为7.6~8.0，用麦芽糖替代葡萄糖为主要碳源，适当补充氨基酸以满足培养过程中氮水平的稳定。（3）脱毒毒素经甲醛加温处理以后，去除毒性而保留其抗原性，形成类毒素。a。脱毒应考虑温度、pH、甲醛浓度以及毒素自身等影响：一般来说温度高、pH高、甲醛浓度高都利于毒素脱毒，但同时却易造成抗原的损失，破坏其免疫原性。毒素浓度过高也不利于毒素脱毒，要适当的稀释。温度一般控制在37~39℃，pH值控制在7.0~7.5较为适宜。b.类毒素生产有脱毒后精制和精制后脱毒两种方式。原制毒素脱毒培养物滤液加0.5%~0.6%甲醛，调pH7.5~7.6,于37~39℃脱毒30d。此法质量稳定，毒性逆转现象极少，但由于含大量培养基残留物质，进一步提高纯度有困难，且脱毒体积大，不利于操作。精制毒素脱毒将精制毒素进行适当稀释后，再脱毒。方法同上。但是为了防止毒性逆转的发生，要加深脱毒20d。工艺紧凑利于操作，且可获得高纯度制品。但是易发生毒性逆转现象，而长时间的脱毒易造成抗原易损伤。（4）白喉类毒素的精制去除细菌代谢的产物（菌体蛋白、小分子有机物等）及培养基中残留的有机物、无机物等非特异性杂志，提高白喉类毒素的纯度，降低接种副反应。a.毒素或类毒素滤液中加入0.5%NaHCO3、23%~27%的硫酸铵、适量的活性炭，溶解后过滤，沉淀废弃，收集滤液。b.上诉滤液再加17%~20%硫酸铵，溶解后过滤，滤液滤清后废弃，收集沉淀。c.收集的沉淀用适量的注射用水溶解，利于透析的方法去除残留的硫酸铵，加入防腐剂（0.01%硫柳汞），除菌过滤。(5)精制类毒素的吸附目的：为使白喉类毒素效力提高，降低接种副反应，利于产生良好的免疫效果，同时减少免疫接种次数。方法：典型的吸附剂为Al(OH)3，以1.5%磷酸盐缓冲液，并加入精制白喉类毒素使其最终含量为30~50Lf/ml。抗体效价测定方法

采用絮状反应法。即以不同量的抗毒素，和一定量的毒素在试管中混合，观察最早发生絮状沉淀反应的一管，计算和一单位抗毒素首先发生絮状沉淀反应的毒素量，即为一个絮状沉淀单位(Lf)。Lf/ml=抗毒素单位/ml*抗毒素ml数÷毒素ml数试验血清每毫升含抗毒素430个抗毒单位，请问第五管毒素量？三、流行性感冒疫苗每年约5亿人患流感，而且流感并发症死亡的人数超过了100万。流感疫苗每人每年需注射一次，接种后7~15天产生抗体，在体内延续一年，基本上能免除或降低流感对身体的危害。对鸡蛋过敏的人应禁止接种发热、急性病及慢性病活动期者应推迟接种。接种疫苗预防流感的有效率可达80％，并可减少类流感77．4％，减轻上感(包括普通感冒)症状44．8％。流感疫苗中作为抗原的主要有效成分是血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)我国目前主要应用的预防流感的灭活疫苗有3种，即：全病毒流感疫苗、流感裂解疫苗、主要由HA和NA抗原制成的亚单位疫苗。每种疫苗均含有甲1亚型、甲3亚型和乙型3种流感灭活病毒或抗原组份。全病毒灭活疫苗免疫原性不错但副作用较大；亚单位疫苗副作用较小但免疫原性一般；裂解疫苗免疫原性和副作用比较理想，且成本低，也是目前世界及中国使用最为普遍的流感疫苗。灭活疫苗的制备：a.将病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9~10日龄鸡胚胎尿囊腔中，32~34℃培养48~80h，收取高滴度的尿囊液和羊水b.以蔗糖为介质进行速率区带超速离心纯化毒粒。蔗糖的浓度为30~50%，25000r/min，15℃离心8h，分步收集合并HA高滴度峰，此步去除大部分杂质并浓缩病毒c.加入灭活剂β-丙烯内脂，20℃灭活72hd.超滤技术脱去蔗糖。分装成成品。流感裂解疫苗：a.将冻干病毒毒种稀释后，接种于无特殊病原体的9~10日龄鸡胚胎尿囊腔中，35℃培养48h，冷却鸡胚，收集尿囊液。b.以10000（相对分子量）超滤膜滤器超滤浓缩后，经Sepharose4FF凝胶柱层析纯化，分步收集毒粒富集液。c.加入终浓度1.0%的TritonX-100裂解90min，再经蔗糖梯度超速离心纯化，分步收集抗原峰。d.合并后超滤除去蔗糖，稀释并配型(四)乙型肝炎疫苗重组CHO细胞乙型肝炎疫苗，利用DNA操作技术将编码HBsAg的基因拼接入CHO细胞染色体中而获得。待培养细胞表达HBsAg含量达到10mg/L以上时收获培养液。（1）沉淀-超速离心-凝胶过滤法上清液以50%饱和(NH4)2SO4溶液沉淀，沉淀物溶解后再以50%饱和(NH4)2SO4溶液沉淀沉淀用生理盐水溶解后超滤两次KBr等密度区带超速离心（25000r/min）分步收集合并密度梯度离心液中HBsAg特异活性峰。过Sepharose4B层析柱，收集洗脱液中的HBsAg富集峰，超滤透析后再经超速平衡离心，收集HBsAg特异活性峰，即制得精制HBsAg（2）三步层析法培养上清液经过Butyl-S-SepharoseFF为介质的疏水作用层析，以DEAE-SepharoseFF为介质的阴离子交换层析以Sepharose4FF为介质的凝胶过滤层析制得精制HBsAg。纯化获得的HBsAg加入终浓度为1：4000的甲醛于37℃保温72h，再经超滤，浓缩及除菌过滤后得到原液，原液吸附Al(OH)3佐剂并加入防腐剂为半成品，经分包装即为成品。一.核酸疫苗简介核酸疫苗(nucleicacidvaccine),也称基因疫苗(geneticvaccine),是指被用作疫苗的带有编码外源蛋白抗原基因的真核表达质粒，包括DNA疫苗和RNA疫苗。

第四节核酸疫苗将含有编码的蛋白基因序列的质粒载体，经肌肉注射或微弹轰击等方法导入宿主体内，通过宿主细胞表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。DNA疫苗导入宿主体内后，被细胞（组织细胞、抗原递呈细胞或其它炎性细胞）摄取，并在细胞内表达病原体的蛋白质抗原，通过一系列的反应刺激机体产生细胞免疫和体液免疫。

核酸疫苗的发展史真正开始于20世纪90年代。

在过去的20世纪中，疫苗研究取得了巨大成功，它是继柯赫、巴斯德等人的科学突破而迅速发展起来的，经历了一个由“期盼”到“实现”这样一个伟大的历史转变过程。疫苗免疫接种所经过的第一次重大变革是由Pasteur等研制开发的减毒或灭活的疫苗，而第二代疫苗包括亚单位疫苗，合成肽疫苗和基因工程疫苗。

二.核酸疫苗产生

1990年，wolff等偶然发现给小鼠肌肉注射外源性重组质粒后，质粒被摄取并能在体内至少两个月稳定地表达所编码蛋白。

1991年，Williams等发现外源基因输入体内的表达产物可诱导产生免疫应答。

1992年，Tang等将表达人生长激素的基因质粒DNA导入小鼠皮内，小鼠产生特异性抗体，从而提出了基因免疫的概念。

1993年，Ulmer等证实小鼠肌肉注射含有编码甲型流感病毒核蛋白的重组质粒后，可有效地保护小鼠抗不同亚型、分离时间相隔34年的流感病毒的攻击。随后的大量动物实验都说明在合适的条件下，DNA接种后既能产生细胞免疫又能引起体液免疫。因此，1994年在日内瓦召开的专题会议上将这种疫苗定名为核酸疫苗。

核酸疫苗的出现与发展是疫苗发展史上的第三次革命。三.核酸疫苗的特点

1免疫保护力增强

2制备简单，省时省力

3同种异株交叉保护

4应用较安全

5产生持久免疫应答

6贮存、运输方便

7可用于防治肿瘤1免疫保护力增强

接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHCI或II类分子结合，同时引起细胞和体液免疫，对慢性病毒感染性疾病等依赖细胞免疫清除病原的疾病的预防更加有效。

2制备简单，省时省力

核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应。

3同种异株交叉保护

这是基因疫苗的最大优点之一。在制备基因疫苗时，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇。

4应用较安全

接种核酸疫苗后，蛋白质抗原在宿主细胞内表达，无因毒力返祖或残留毒力病毒颗粒而引发疫病的危险，也不会引起对机体的不良反应。

5产生持久免疫应答

免疫具有持久性，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫。Wolff等报道，在注射后19个月仍可检测到外源基因相当数量的表达。6贮存、运输方便

核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。

7可用于防治肿瘤

细胞毒性T细胞

（CytotoxicTLymphocytes，CTL）应答也是机体杀死癌变细胞的有效清除途径。若能找到在细胞恶性转化过程中的关键蛋白就能制备肿瘤的CTL疫苗。该基因疫苗接种后，可诱发机体产生CTL免疫应答，对细胞的恶变进行免疫监视，对癌变的细胞产生免疫应答从而为癌症的预防和免疫治疗提供强有力的新式武器。第五节DNA重组药物一、概述DNA重组药物，又称基因工程药物（geneticallyengineereddrug），是指利用DNA重组技术（基因工程技术）研制和生产的药物，主要包括重组蛋白质药物、多肽药物、反义核酸药物、DNA药物和基因工程抗体等。二、DNA重组药物的特点稳定性差，易腐败使用量低，但药理活性极高具有细胞和组织特异性注射用药有特殊要求三、DNA重组药物制备举例（一）干扰素（interferon;IFN）干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。干扰素有Ⅰ型和Ⅱ型，以及干扰素样细胞因子，Ⅰ型干扰素有7种：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人类没有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型仅有IFN-γ。rhIFNα-2b生产工艺理化性质

IFNα-2b是由165个氨基酸组成的单肽链蛋白质，含四个Cys残基，形成两个二硫键。2.制备原理与制备工艺路线用基因工程方法构建阳性质粒pGAPZαA，通过大肠杆菌获得大量载体，然后转化酵母SMD1168，从而获得阳性酵母菌落，通过高浓度的Zeocin（博来霉素）筛选获得高表达工程菌，在pH4.0~5.0、300r/min、30℃培养至OD6006~8时，获得最大量rhIFNα-2b，上清液依次通过阴离子和阳离子交换及冻干等步骤，获得纯品。IFNα-2b的目的基因PichiapastorisSMD1168转化大肠杆菌pGAPZαA质粒IFNα-2b的目的基因杂交质粒pGAPZαA线性pGAPZαA质粒阳性质粒pGAPZαA线性阳性质粒pGAPZαA高表达工程菌上清液IFNα-2b的原液IFNα-2b成品[酶切]XhoⅠ、XbaⅠXhoⅠ、XbaⅠ[连接]T4连接酶[转化][转化][酶切]AvrⅡ[发酵、离心][冻干][筛选]Zeocin[筛选]Zeocin[色谱]CM-SepharoseF.F,DEAE-SepharoseF.F图1重组干扰素α-2b的制备工艺质粒pGAPZαA3.工艺制备过程基因的制备根据hIFNα-2b一级结构和pGAPZαA的组成设计引物，通过PCR进行扩增构建重组质粒用XhoI/XbaI分别酶切hIFNα-2b/T-Vector和pGAPZ

αA，回收目标片段后按常规方法构建表达质粒，即将基因插入pGAP启动子和α-factor信号肽下游的XhoI/XbaI位点，构建成分泌型酵母表达重组质粒酵母转化以AvrⅡ酶切载体呈线性化并转化酵母P.pastorisSMD1168和GS115（作为对照），经YPD+Zeocin100mg/L平板筛选和PCR鉴定分析，确定阳性菌株。发酵及表达产物的SDS分析构建干扰素酵母工程菌后，-80℃保存菌种；发酵前接种平板使