分离工程第三章课件

第三章沉淀与泡沫分离第一节沉淀什么是沉析？沉析法纯化蛋白质的优点有哪些？沉析的一般操作步骤是什么？何谓盐析？其原理是什么？盐析操作时常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？通过本章学习应掌握以下内容沉淀（Precipitation）：是物理环境的变化引起溶质溶解度降低，生成固体凝聚物的现象。结晶：由溶解度降低引起的固体成相现象。沉淀的纯度远低于结晶，是一种初级分离技术。但多步沉淀操作也可制备高纯度的目标产物，相当于重结晶，沉淀分级目前主要用于蛋白质的分离。常用沉淀方法的分类一、盐析沉淀β和Ks的物理意义β—盐浓度为0时，蛋白质溶解度的对数值。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关；Ks—盐析常数，与蛋白质和无机盐的种类有关，与温度、pH值无关。Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；

其中，Ks盐析法由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，因此常用于提取液的前处理。而β盐析法由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的纯化。蛋白质分子表面的疏水区域，聚集了许多水分子，盐浓度高时，这些水分子被盐抽出，暴露出的疏水区域相互结合，沉淀。盐析（（NH4）2SO4）盐析过程当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象—低盐浓度下，蛋白质溶解度增大（2）“盐析”现象—高盐浓度下，蛋白质溶解度随之下降，原因如下：无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；Electricdoublelayer选择盐析盐时还应考虑：a、溶解度大。b、溶解度受温度影响较小；c、盐溶液密度不高，利于沉淀的沉降或离心分离。d、常用的盐析盐是(NH4)2SO4，此外还有Na2SO4和NaCl。盐析用盐的选择在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱（Ks）磷酸钾>硫酸钠>硫酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁

(2)温度和pH值（影响）

高离子强度下，温度升高，蛋白质溶解度下降,减小。pH值接近蛋白质pI值时，蛋白质溶解度最小。(三)、盐析操作(以硫酸铵为例)确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实验步骤（设操作温度为0℃）：取部分料液，分成等体积的几份，冷却至0℃；用下式计算饱和度（浓度相当于饱和浓度的百分数）达到20％~100％所需加入硫酸铵量，并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h以上，同时保持温度在0℃；其中：W为硫酸铵加入量（g/L)；S1和S2为饱和度；505为0℃时硫酸铵饱和浓度（质量百分比，g/L）；0.285为0℃时硫酸铵饱和浓度（体积百分比，L/L）。3000g下离心40min，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测定其中总蛋白和目标蛋白浓度；分别测上清液中总蛋白和目标蛋白的浓度，比较沉淀前后蛋白质是否保持物料守恒；

以上清液中总蛋白和目标蛋白浓度对饱和度作图，从而可根据所要求达到的目标蛋白纯化倍数和回收率确定硫酸铵的加入量。(四)、应用由于盐析沉淀后产物中盐含量较高，故一般在盐析沉淀后，需进行脱盐处理，才能进行后续的纯化操作。

二、等电点沉淀等电点(pI)：蛋白质静电荷为零时的pH值为其等电点.利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法（Isoelectriprecipitation）。操作条件：低离子强度；pHpI。低离子强度调pH值至等电点，或在等电点的pH下利用透析方法降低离子强度，使蛋白质沉淀。适用于疏水性大蛋白质（如酪蛋白），对于亲水性强的蛋白质（如明胶）则不太适用。特点：优点：无需后续的脱盐操作。缺点：由于操作pH过低，容易引起目标蛋白质的失活.

三、有机溶剂沉淀定义：向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂，造成蛋白质分子表面水化程度降低，从而发生沉淀的方法。例：血浆蛋白质的分离纯化，至今仍用此法常用的有机溶剂沉析剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；特点：介电常数小，60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22容易获取当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，因而静电吸引力增大。操作条件：低离子强度；等电点附近。加入有机溶剂充分搅拌，快速，蛋白质与有机溶剂接触时间短。特点：优点：有机溶剂密度较低，易于沉淀分离；不需后续脱盐处理；缺点：易引起蛋白质变性，须在低温下进行。有机溶剂沉析的特点分辨率高；溶剂容易分离，并可回收使用；产品洁净；容易使蛋白质等生物大分子失活；应注意在低温下操作；成本高溶剂选择介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中水溶性要好影响有机溶剂沉析的主要因素温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）；搅拌速度：散热溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI）离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L样品浓度:0.5~2%稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+本法应用，注意下列各点：（1）降低温度，能增加收率和减少蛋白质变性，加有机溶剂于水常为放热反应，故操作时需冷却。例：乙醇沉淀血浆蛋白，在-10℃下进行。（2）所选溶剂必须能与水互溶，而和蛋白质不起作用，常用乙醇、丙酮。（3）蛋白质分子量越大，产生沉淀需加入的有机溶剂量越少。如用丙酮作沉淀剂有下列关系式：[所需丙酮量]=1.8-0.12[蛋白质分子量]（4）一种蛋白质溶解度会由于另一种蛋白质存在而降低。（5）沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。（6）接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂量少。（7）少量中性盐（0.1~0.2molL-1)的存在能产生盐溶作用，增加蛋白质在有机溶液水溶液中的溶解度，使沉淀蛋白质所需有机溶剂量增大，一般I=0.05或稍低为最好，既能使沉淀迅速形成，又能对蛋白质起保护作用。（8）盐析法制蛋白质透析除盐，进一步纯化可用有机溶剂沉淀。四、热沉淀（Thermalprecipitation)定义：利用在较高温度下，热稳定性差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热稳定性高的目标蛋白的方法。热沉淀基于蛋白质的变性动力学。假设变性过程符合一级反应规律：操作条件：调节pH；加入有机溶剂。特点：是一种变性分离法，带有冒险性，需对目标蛋白和共存杂蛋白的热稳定性有充分了解。五、其他沉淀法（一）、非离子型聚合物沉淀法

机理不清，可能是降低蛋白质分子表面的水化程度或空间排阻作用。常用聚合物：聚乙二醇（PEG）。PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒、不可燃烧且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉淀分离蛋白质的优点：1、体系温度只须控制在室温下。2、沉淀的颗粒较大，产物易收集。3、PEG不会使蛋白变性。PEG沉淀分离蛋白质的缺点：PEG很难从蛋白质溶液中除去，须用超滤和液-液萃取解决。PEG分子量需大于4000，最常用6000和20000。所用PEG浓度通常为20%，浓度再高会使黏度增大，造成沉淀回收困难，若PEG对后继分离步骤影响较小，可以不必除去。蛋白质溶解度与PEG浓度之间的关系：lgS=lgS0-k[PEG]S:PEG存在时浓度，S0:无PEG时浓度，k:常数，与蛋白质和PEG分子大小有关。（二）、聚电解质沉淀法沉淀机理：与絮凝类似，在蛋白质之间起架桥作用，同时还兼有盐析作用。应用：主要用于酶和食品蛋白的回收常用的聚电解质：酸性多糖、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶和羧甲基纤维素等。聚电解质是长链状结构，链上有许多活性官能团，如：-COOH、NH4+等离子型基团，通过静电引力、范德华力、氢键强烈吸附胶体表面，产生架桥作用。链越长，活性基团越多，效果越好。（三）、金属离子沉淀法沉淀机理：可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋白质沉淀。如Ca2+和Mg2+能与羧基结合，Mn2+和Zn2+能与羧基、含氮化合物以及杂环化合物结合。优点：可使浓度很低的蛋白质沉淀；沉淀后金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。第二节泡沫分离自学思考题1、名词解释：盐析和盐溶、蛋白质的等电点、蛋白质变性。2、扼要解释为什么大多数球状蛋白质在溶液中具有下列性质？（1）在低pH值时沉淀。（2）当离子强度从零逐渐增加时，其溶解度开始增加，然后下降，最后出现