酶六章酶的固定化

酶六章酶的固定化第一页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶催化的优点

——作为一种生物催化剂，酶参与生物体内的各种代谢反应，具有专一性强、催化效率高及作用条件温和等优点。第二页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶催化的缺陷

——酶对环境影响十分敏感，各种物理、化学和生物因素（如温度、压力、电磁场、氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH、酶修饰和酶降解等）都可能使酶丧失生物活力。第三页，共一百五十八页，2022年，8月28日

在过去的科学研究和生产实践中，酶一直都是以溶于水的游离状态进行催化反应的，但游离酶即使在酶反应的最适条件下进行催化，也还存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，有时不易与产物分开，影响产品提纯及质量。第四页，共一百五十八页，2022年，8月28日设想

——如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相，使它与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。

——这种固定化的酶可以象一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。第五页，共一百五十八页，2022年，8月28日进展

——经过40多年的研究和发展，酶的固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在实际应用上也显示出强大威力。

——用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。第六页，共一百五十八页，2022年，8月28日现状

——人们对固定化酶极感兴趣，因为其性质比可溶性酶及其相关技术优越，对固定化酶的利用也与日俱增。第七页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶的定义

——所谓固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。

——不管用何种方法制备的固定化酶，都应该满足上述固定化酶的条件。第八页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶与游离酶相比，具有下列优点

（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；

（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装

柱连续反应；

（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；

（4）酶反应过程能够加以严格控制；

（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工

艺；

（6）较游离酶更适合于多酶反应；

（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；

（8）酶的使用效率提高，成本降低。

第九页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶是二十世纪五十年代开始发展起来的一项新技术、最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme）和“固相酶”（solidphaseenzyme）。第十页，共一百五十八页，2022年，8月28日

但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。第十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不恰当了。第十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶正式定名

在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”（immobilizedenzyme）的名称。第十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日历史上较大的时事件1916年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith第一次实现了酶的固定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，Immobilizedenzyme第十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶的固定化方法第十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶的制备原则

——固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于固定化制备的物理、化学手段、材料等多种多样。第十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日

制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原则第十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则1

——必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。第十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则2

——固定化应该有利于生产自动化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。第十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则3

——固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量，制备固定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。第二十页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则4

——酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能地结合牢固。第二十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则5

——固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。第二十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则6

——固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性，在制备固定化酶时，酶和载体结合部位不应是酶的活性中心或与维持酶高级空间结构有关的基团，因此，应尽可能预先保护这些基团；第二十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则7

——固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用；第二十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日原则8

——固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。第二十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶的固定化方法

——酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。第二十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类固定化方法分类非化学结合法结晶法分散法物理吸附法离子结合法化学结合法交联法共价结合法包埋法

微囊法网格法第二十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日（一）非共价结合法

——1结晶法

——2分散法

——3物理吸附法

——4离子结合法第二十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日结晶法

——就是使酶结晶从而实现固定化的方法。

——对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。

——提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。第二十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日结晶法的局限性

——在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。

第三十页，共一百五十八页，2022年，8月28日2分散法

——通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。

——对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂中，并且可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。第三十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

对于用在水不溶性溶剂中的固定化酶，有许多途径可以提高它们的反应速率第三十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日①正确的体系和贮存状态使酶粉末充分分散，将有助于提高活力。

——在干燥过程中，加入多种化合物有助于酶的分散，这些化合物也作为稳定剂和保护剂发挥作用。第三十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日②通过与亲脂化合物的共价连接

能增加酶在有机相中的溶解度

——可以通过将其包埋在膜体系中或通过多相反应来实现酶的固定化。第三十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日③酶的固定化。

——将酶简单地吸附到多孔载体中就能显著地增加单一催化中心的获得，并且易于从产物中分离酶。

——交联的晶体需要表面活性剂来补偿它们在有机相中的低活力。第三十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日3.物理吸附法

——酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。第三十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日载体

——无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；

——天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；

——大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；

——具有疏水基的载体（丁基或已基­-葡聚糖凝胶）可以疏水性吸附酶，以及以单宁作为配基的纤维素衍生物等载体。第三十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日物理吸附法也能固定微生物细胞，并有可能在研究此法中开发出固定化增殖微生物的优良载体。第三十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日

物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。

——若能找到适当的载体，这是很好的方法。

——但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。第三十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日4.离子结合法

——酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定化方法。第四十页，共一百五十八页，2022年，8月28日载体

——阴离子交换剂如DEAE-纤维

素，DEAE-葡聚糖凝胶，

AmberliteIRA-93，410，

900；

——阳离子交换剂如，CM-纤维

素，AmberliteCG-50，IRC-

50，IR-120，Dowex-50等。第四十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日离子结合法的优点

——操作简单，

——处理条件温和，

——酶的高级结构和活性中心的

氨基酸残基不易被破坏，能

得到酶活回收率较高的固定

化酶。第四十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日缺点

——载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。第四十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日离子结合法也能用于微生物细胞的固定化，但是由于微生物在使用中会发生自溶。

——用此法要得到稳定的固定化微生物较为困难。第四十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日迄今已有许多酶用离子结合法固定化，例如1969年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。第四十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日（二）化学结合法

——1共价结合法

——2交联法第四十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日共价偶联法第四十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶第四十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日共价结合法

酶与载体以共价键结合的固定化方法

方法：

——将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。

——另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。第四十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日可与载体共价结合的酶的功能团

——或氨基、、或-羧基、巯基、

羟基、咪唑基、酚基等。

——参与共价结合的氨基酸残基不应是

酶催化活性所必需的，否则往往造

成固定后的酶活性完全丧失。第五十页，共一百五十八页，2022年，8月28日共价结合法与离子结合法或物理吸附法相比的优点

——酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。第五十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日缺陷

—反应条件苛刻，操作复杂；

—会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。

因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为30％左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。第五十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日所用载体分三类

——天然有机载体（如多糖、蛋白质、细

胞），

——无机物（玻璃、陶瓷等）

——合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）第五十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日

载体的活化方法依载体性质各不相同第五十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日羟基聚合物

纤维素、葡聚糖、琼脂糖及胶原等可用溴化氰法、活化酯法、环氧化法及三嗪法等。第五十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日溴化氰法第五十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日

溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层析的固定化吸附剂。第五十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日活化酯法第五十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日环氧化法第五十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日三嗪法三氯-均-三嗪 三氯-均-三嗪纤维素第六十页，共一百五十八页，2022年，8月28日醛基载体

——纤维素葡聚糖经过碘酸氧化或用二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，产生二醛高聚物，每个葡萄糖分子含二个醛基。第六十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日第六十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日羧基载体第六十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日多胺载体第六十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日第六十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日无机载体

——可采用直接法和涂层法（用活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）第六十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日

第六十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日交联法

——用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。

——与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。第六十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日参与交联反应的酶蛋白的功能团

——N末端的-氨基

——赖氨酸的-氨基

——酪氨酸的酚基

——半胱氨酸的巯基

——组氨酸的咪唑基等第六十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日交联剂

——形成希夫碱的戊二醛，

——形成肽键的异氰酸酯，

——发生重氮偶合反应的双重氮联苯

胺或N，N’-乙烯双马来亚胺等。

最常用的交联剂是戊二醛。第七十页，共一百五十八页，2022年，8月28日第七十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日特点

——交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回收率一般较低，

——尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。

第七十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日（三）包埋法

——网格型

——微囊型第七十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日网格型

——将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型第七十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日网格型第七十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日微囊型

——将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。第七十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日微囊型第七十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日特点

——包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。

——但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。第七十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日——由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。

——因此，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。第七十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日常用的载体材料

1.网格型

——聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等合成高分子化合物

——淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉菜胶等天然高分子化合物。第八十页，共一百五十八页，2022年，8月28日——合成高分子化合物常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下聚合的方法，

——溶胶状天然高分子化合物则在酶或微生物存在下凝胶化。第八十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。第八十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日2.微囊型

——微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。

——制备微囊型固定化酶方法。

——界面沉淀法

——界面聚合法

——二级乳化法：第八十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日（1）界面沉淀法

——利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。第八十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日例子

——先将含高浓度血红蛋白的酶溶液在水不互

溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性

剂存在下形成油包水的微滴，再将溶于有

机溶剂的高聚物加入乳化液中，

——然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，

使高聚物在油—水界面上沉淀、析出、形

成膜，将酶包埋，

——最后在乳化剂的帮助下由有机相移入水相第八十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日方法的特点

——条件温和，酶失活少，

——但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。第八十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日

作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。

第八十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日（2）界面聚合法

——利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。第八十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日例子

——将含10％血红蛋白的酶溶液与1，6-

己二胺的水溶液混合，

——立即在含1%Span-85的氯仿-环乙烷

中分散乳化，

——加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在

油-水界面上发生聚合反应，形成尼

龙膜，将酶包埋。

除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。第八十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日方法的特点

——制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非常短。

——但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。第九十页，共一百五十八页，2022年，8月28日（3）二级乳化法

——酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含着多滴酶液。第九十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日方法的特点

——制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。

第九十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日

此外还有脂质体包埋法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。第九十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日各种固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合法交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能可能不可能不可能不可能固定化费用低低中中高第九十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日—包埋、共价结合、共价交联三种虽结

合力强、但不能再生、回收；

—吸附法制备简单，成本低，能回收再

生，但结合差，在受到离子强度、pH

变化影响后，酶会从载体上游离下来。

在使用价格较高的酶与载体时可行；

—包埋法各方面较好，但不适于大分子底

物和产物。没有一个方法是十全十美的，几种方法各有利弊第九十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化酶的性质第九十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日

固定化是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。第九十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日1影响固定化酶性能的因素

—固定化酶制备物的性质取决于

所用的酶及载体材料的性质。

—酶和载体之间相互作用使固定

化酶具备了化学、生物化学、

机械及动力学方面的性质。

第九十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日成分参数酶生物化学性质分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数专一性，pH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pH，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载体化学特征化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性机械性质颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（流体床），对搅拌罐的磨损。固定化酶固定化方法所结合的蛋白，活性酶的产量，内在的动力学参数（即无质量转移效应的性质）质量转移效应分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性效能生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）固定化酶的特征参数第九十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日2固定化后酶活性变化

固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改变。第一百页，共一百五十八页，2022年，8月28日例如

用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的30%，而对低分子底物苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。第一百零一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：

①酶分子在固定化过程中，空间构象会有

所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸

②固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对

底物的定位作用；

③内扩散阻力使底物分子与活性中心的接

近受阻；

④包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大

分子底物不能过膜与酶接近。第一百零二页，共一百五十八页，2022年，8月28日

值得注意的是

——也有个别情况，酶在固定化后反

而比原酶活力提高。

——原因可能是偶联过程中酶得到化

学修饰，或固定化过程提高了酶

的稳定性。第一百零三页，共一百五十八页，2022年，8月28日3固定化对酶稳定性的影响

稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题第一百零四页，共一百五十八页，2022年，8月28日酶的稳定性包括

——热稳定性

——对各种有机试剂稳定性

——对酶抑制剂的稳定性

——对不同pH（酸度）稳定性

——对蛋白酶稳定性

——贮存稳定性

——操作稳定性第一百零五页，共一百五十八页，2022年，8月28日在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。第一百零六页，共一百五十八页，2022年，8月28日Merlose曾选择50种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现其中有30种酶经固定化后稳定性提高，12种酶无变化，只有8种酶稳定性降低。第一百零七页，共一百五十八页，2022年，8月28日热稳定性

固定化酶的稳定性变化固定化酶；2.自然酶第一百零八页，共一百五十八页，2022年，8月28日固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点：

—①固定化后酶分子与载体多点连接

，可防止酶分子伸展变形。

—②酶活力的缓慢释放。

—③抑制酶的自降解。将酶与固态载

体结合后，由于酶失去了分子间

相互作用的机会，从而抑制了降

解。第一百零九页，共一百五十八页，2022年，8月28日

然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。第一百一十页，共一百五十八页，2022年，8月28日4固定化酶的最适温度变化

——酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。

——当然，也有报道最适温度不变或下降的。第一百一十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日5固定化酶的最适pH变化

—酶由蛋白质组成，其催化能力

对外部环境特别是pH非常敏感。

—酶固定化后，对底物作用的最适

pH和pH-活性曲线常常发生偏移第一百一十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；2.游离酶第一百一十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日6固定化酶的米氏常数（Km）变化

——固定化酶的表观米氏常数Km随载体的

带电性能变化。

——与溶液酶相比，固定化酶即使在溶液

的底物浓度较低时，也可达到最大反

应速度，即固定化酶的表观Km值低于

溶液的Km值；

——简单说，由于高级结构变化及载体影

响引起酶与底物亲和力变化，从而使

Km变化。第一百一十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日

辅酶的固定化第一百一十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅酶的定义

约1/3的酶的催化作用得以进行需要存在另一种非蛋白质性质的化合物，这些小分子物质统称辅因子，它们的存在是酶表现其催化作用的必要条件，缺少它们，酶就不能表达其活性。第一百一十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅酶的分类

—无机辅因子，是简单的金属

离子，例如Mg2+，Mn2+等

—有机辅因子，是一种与酶蛋白

或紧或松地联结在一起的有机

物质。第一百一十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日其中有机辅因子有两类

——辅酶

——辅基第一百一十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日①辅酶（酶间载体）

——作用是从某反应向另一反应传递物质。它们与酶蛋白结合得比较松散，并且往往能够通过透析法除去。第一百一十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日例

脱氢酶反应中需要的辅酶I（NADH和NAD+）和辅酶II（NADPH和NADP＋）能传递电子，连接酶在催化生物合成反应中所需要的ATP能传递磷酸基，以及辅酶A（CoA）能传递乙酰基等。第一百二十页，共一百五十八页，2022年，8月28日②辅基（酶间传递）

——与酶蛋白结合相当紧密，用透析法不易除去，必须经过一定的化学处理才能使之分离。它是酶活性中心的组成部分。第一百二十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日例如

——过氧化氢酶中的铁卟啉，黄素酶类中的黄素核苷酸（FMN和FAD）及B6、B12等。第一百二十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅基/辅酶和维生素维生素

脂溶性维生素：ADEK

维生素硫辛酸（氧化型）水溶性维生素：VcVB:B1B2B3（泛酸）

B5(PP)B12（氰钴胺素）

B6(吡哆醇/醛/胺）

B7(生物素）硫辛酸（还原型）第一百二十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日2.辅基辅酶在酶促反应中的作用

——传递电子、原子或某些基团传递氢的辅基/辅酶

1.辅酶I/辅酶II及维生素PP

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD/CoI）烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP/CoII）

NAD+（NADP+

）NAD(P)H+H++2H+,2e-2H+,2e第一百二十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日2.黄素核苷酸和维生素B2

（1）黄素单核苷酸（FMN)(2)黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD)

FMN（FAD)FMNH2（FADH2)

3.维生素C（抗坏血酸）

4.泛醌（辅酶Q)5.谷胱甘肽2GSHGSSG

+2H+,+2e-2H+,-2e-2H+2H++2H++2H第一百二十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日二.传递电子的辅基—铁卟啉

Fe3+Fe2+三.转移基团的辅基/辅酶1.传递磷酸根的辅酶—腺苷磷酸酯(ATP/ADP/AMP)转移磷酰基

ATP+SADP+P-S转移糖基ATP+糖-P

ADP-糖+PPi转移AMP

ATP+FMNFAD+PPi转移腺苷ATP+Met+H2O腺苷-Met+

PPi+Pi能量的载体ATP+H2OADP+Pi+e-e第一百二十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日三.转移基团的辅基/辅酶2.脱羧的辅酶—硫胺素焦磷酸（TPP)

硫胺素+ATPTPP+AMP3.转移酰基的辅酶（1）辅酶A和泛酸CoA-SH+RCOOHCoA-S-COR+H2O

CoA-S-COR+底物底物-COR+CoA-SH（2）硫辛酸和VB1mg硫胺素激酶第一百二十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日(2）硫辛酸和VB1

第一百二十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日4.转移氨基的辅酶和VB6—磷酸吡哆醛（PLP)/磷酸吡哆胺(PMP)

AA酮酸

PCHOPCH2NH2

5.固定CO2的辅酶—生物素和VB76.转移一碳基团的辅酶

(1)四氢叶酸（FH4)(2)钴铵素和VB12

酮酸AA第一百二十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日

有机辅因子分子中具有某些特殊的化学基团，它们能直接与底物反应，起着递氢、递电子或递某些化学基团的作用。第一百三十页，共一百五十八页，2022年，8月28日——不少酶还同时需要金属离子和有机辅因子。辅基和辅酶与对应的酶有专一的亲和性，酶蛋白与有机辅因子相结合便形成全酶

——由于有机辅因子的价格较昂贵，所以在工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生。第一百三十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

在反应之后，大多数有机辅因子不能自行再生，其结构往往发生改变。

因此，它们在继续使用之前，必须进行回收和再生，由于辅基与酶蛋白的结合比较牢固，通常可以用超滤膜截留等物理方法进行回收。第一百三十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日

对于辅酶来说，直接用超滤膜截留并不理想，因为辅酶分子一般较小，所用的超滤膜必须十分致密，才能阻止它的流失，这样势必增加流体的流动阻力，使反应产率降低。第一百三十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日

为使辅酶能在酶反应系统中有效的参与反应，必需考虑辅酶的固定化。将辅酶固定在可溶性的或不可溶性的大分子载体上，这样就便于回收再生。第一百三十四页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅酶的固定化方法第一百三十五页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅酶的固定化方法——辅基的固定化——辅酶的固定化第一百三十六页，共一百五十八页，2022年，8月28日（一）辅基的固定化

——应选择合适的载体

——间隔臂（手臂）的选择

第一百三十七页，共一百五十八页，2022年，8月28日理想的载体应具有以下的条件

——没有特异性吸附

——具有多孔性

——有适合引入配基的官能团

——化学稳定性

——具有适当的机械强度等。第一百三十八页，共一百五十八页，2022年，8月28日目前使用的载体主要有

——琼脂糖

——纤维素

——玻璃珠

——合成高分子载体等

第一百三十九页，共一百五十八页，2022年，8月28日间隔臂（手臂）的选择

——一般辅基分子和载体之间需

要0.5~1.0nm长的手臂

——考虑辅基的性质，如：疏水

性、亲水性、离子性和体积大

小等因素。第一百四十页，共一百五十八页，2022年，8月28日——要将辅基共价偶联于载体上，首先必须在不影响辅基活性的分子部位引入适当的功能团。

——一般引入羧基或氨基后，与载体偶联比较容易。

——如果辅基分子本身具有不参与催化活性的适当的功能团时，就不必预先引入功能团。第一百四十一页，共一百五十八页，2022年，8月28日

辅酶固定化所用的偶联反应

WSC：碳二亚胺；（a）与CNBr活化的琼脂糖直接偶联；（b）与具有间隔臂的载体偶联。第一百四十二页，共一百五十八页，2022年，8月28日（二）辅酶的固定化

——辅酶的固定化方法与酶相似，一般采用溴化氰法，碳二亚胺法以及重氮偶联法等共价偶联，或将其进行适当的化学修饰后用在超滤器中。第一百四十三页，共一百五十八页，2022年，8月28日辅酶NAD+在琼脂糖上的固定化第一