四沉淀技术教学课件

沉淀技术YOURSUBTITLEGOESHERE生物分离过程的一般流程原料液细胞分离(离心，过滤)细胞－胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液－胞外产物粗分离(沉淀/超过滤/萃取)纯化(层析、离子交换、吸附)脱盐(凝胶过滤、超滤)浓缩(超滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。沉淀法的目的：通过沉淀达到浓缩的目的；沉淀方法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，但目前仍广泛应用在工业上和实验室中。蛋白质表面性质P49蛋白质是两性高分子电解质（amphotericpolymer），主要由疏水性各不相同的20种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。蛋白质的溶解特性蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。盐析P51概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在1859年，中性盐盐析法就被用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。

盐析法机理P51（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。盐析过程

当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)—低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)—高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济盐析用盐的选择P52盐析中常用的盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1）价廉；（2）溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；（3）硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，（4）不易引起蛋白质变性。

缺点：（1）水解变酸；（2）高pH释氨，腐蚀；（3）残留产品有影响。盐析操作(加盐方式）P53硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法

用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法

用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法

先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。㏒S=β-ＫsＩS—蛋白质的溶解度，g/L;I－离子强度，

I=1/2∑mizi2

mi—离子i的摩尔浓度；Zi—所带电荷β—常数，图中截距Ks—盐析常数，图中直线斜率Cohn经验式P52

蛋白质溶解度与盐浓度的关系用盐析法分离蛋白质的二种方法第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH,温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。影响盐析的因素盐析的影响因素：pH值一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液PH值调到目的蛋白的等电点处。注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液PH值，以达到最好的盐析效果。

盐析的影响因素：蛋白质浓度沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。因此需要在两者之间进行适当选择。分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25mg/mL～30mg/mL。盐析注意事项选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH用磷酸缓冲液在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤等电点沉淀法

isoelectricpointprecipitation等电点沉淀法在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀的操作称为等电点沉淀不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。

pH=pI图16-10表示大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况。等电点沉淀法等电点沉淀法注意事项本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成粗大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。如明胶，则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用:在调节等电点时，如果采用盐酸、氢氧化钠等强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸、碳酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。有机溶剂沉淀法

organicsoventprecipitation概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。优点：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白阿质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点:1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法机理

A降低溶剂介电常数（介电常数D有机<D水）

，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，增加了酶、蛋白质、核酸等带电粒子之间的作用力，因相互吸引而聚合沉淀。B破坏水化膜：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，降低蛋白质分子的溶剂化能力，破坏蛋白质的水化层，使蛋白质沉淀。C相反力：疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层有机溶剂沉淀法机理降低介电常数破坏水化膜常用的有机溶剂沉析剂选择依据：水溶性要好介电常数要小致变性作用要小（甲醇）毒性要小、挥发性适中容易获取沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广

1、温度

使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，从而增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。因此，所用的有机溶剂须预先冷却到-10－-20℃；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行。

有机溶剂沉淀法的影响因素2、pH值：pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。3、样品浓度：样品较稀时，将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。一般认为蛋白质的初浓度以0.5～2％为好，粘多糖则以1～2％较合适。4、中性盐浓度：较低浓度的中性盐存在有利于沉淀作用，减少蛋白质变性。一般中性盐浓度以0.01～0.05mol/L为好，常用的中性盐为醋酸钠、醋酸铵、氯化钠等。5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与某些成阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶剂用量。有机溶剂沉淀法的影响因素非离子型聚合物用聚乙二醇等非离子性聚合物亦能降低蛋白质的溶解度，有选择性的沉淀蛋白质。机理：与有机溶剂相似，能降低水活度，破坏蛋白质的水化膜。常用非离子性聚合物为Polyethyleneglycol(PEG)：是一种水溶性的高分子聚合物，分子量4,000以上的PEG可以用来沉淀蛋白质。优点：1.室温2.颗粒大，易于收集3.提高蛋白质的稳定性4.PEG难去除，幸而PEG通常一般不影响下一步的分离。机理：架桥与静电离子型多糖聚合物，酸性多糖羧甲基纤维素、海藻酸钠，食品蛋白的沉淀。合成的离子聚合物：聚丙烯酸（pH2.890%蛋白沉淀）聚苯乙烯季胺盐（pH10.4,95%蛋白沉淀）聚甲基丙烯酸聚乙烯亚胺聚电解质沉淀成盐类复合物沉淀此类沉析剂有以下三种：（1）高价金属盐：Cu2+，Ag2+，Zn2+，Ca2+与酸性基团结合；（2）苦味酸盐、单宁酸盐、鞣质等，与碱性基 团结合（3）无机复合盐：磷钨酸盐、磷钼酸盐等缺点：容易导致活性蛋白的不可逆变性，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。１）金属离子沉淀金属离子的沉淀作用是由于它们能与蛋白质分子中的特殊部位起反应造成的。例如锌易与組胺酸残基中咪唑基结合，从而降低蛋白质的溶解度。金属离子在蛋白质分级沉淀上的应用可以追溯到1905年，真正的认识是后来从金属离子与纯血浆蛋白的特异相互作用的研究中得到的。Zn2+用于沉淀杆菌肽、尿激酶和胰岛素。Ca2+（CaCO3）用于分离乳酸，血清蛋白和柠檬酸。硫酸钡在柠檬酸生产中用以去除重金属高于，MgSO4用以去除DNA和其他核酸；成盐类复合物沉淀金属离子沉淀蛋白质一般可分三类：①能与羧基、胺基等含氮化合物以及含氮杂环化合物强烈结合的一些金属离子，如：Mn2+、Fe2+、Ｃo2+、Ni2+、Ｃu2+、Zn2+、Cd2+;②能与羧酸结合而不与含氮化合物结合的一些金属离子，如：Ca2+、Ba2+、Mg2+、Pb2+;③能巯基化合物强烈结合的一些金属离子，如：Ｈg2+、Ag2+、Pb2+。实际应用时，金属离子的浓度常为0.02mol/L。复合物中金属离子的去除，可用离子交换法或EDTA金属螯合剂。2．有机盐法

含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。但此法常发生不可逆的沉淀反应3．无机复合盐法：如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成硫化物而除去；若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。成盐类复合物沉淀亲和沉淀

affinityprecipitation亲和沉淀是分离过程的一部分，但是其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同。它是利用蛋白质与特定的生物合成分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术所以其沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。亲和沉淀亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。①初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀；②所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。16.9选择性变性沉淀法选择性变性沉淀法：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质