水稻160基因的酵母双杂交质粒的构建

水稻160基因的酵母双杂交质粒的构建摘要目的利用酵母双杂交系统，构建水稻160基因酵母双杂交质粒，并对其进行阳性克隆挑选和双酶切凝胶电泳以及测序鉴定。为后期实验利用酵母双杂交技术挑选相互作用蛋白奠定了出实验依据。方法根据GenBank中登录的LOC_Os06g49160基因编码区序列设计引物，以p30-GFP质粒为模板，用聚合酶链式反应扩增目的片段，纯化后用XbaI、BamHI双切水稻160基因和质粒载体p30-GFP，回收纯化后的产物并在特定条件下连接成重组质粒，重组质粒命名为p30-GFP-160，连接完成之后再使用双酶切后通过电泳图谱证实连接是否成功并采用基因测序的方法验证序列变化。结果通过电泳图谱可知扩增的目的片段大小约为750bp，与预期大小相符合，目的片段与p30-GFP载体定向重组形成的诱饵质粒p30-GFP-160经BamHⅠ和XabⅠ双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图谱与预期基本一致，基因测序结果也表明已成功构建出质粒。结论成功构建了水稻160基因酵母双杂交质粒，可用于后续水稻中相关蛋白筛选实验，并为进一步使用酵母双杂交技术去探究蛋白质之间相互作用确立了理论与实验基础。关键词：LOC_Os06g49160；质粒构建；酵母双杂交系统；p30-GFP载体

ABSTRACTObjective：Toconstructayeasttwo-hybridplasmidofrice160geneusingtheyeasttwo-hybridsystem,andperformpositivecloneselection,doubleenzymedigestiongelelectrophoresisandsequencingforidentification.Itlaidanexperimentalbasisforthelaterexperimentstouseyeasttwo-hybridtechnologytoselectinteractingproteins.Methods：PrimersweredesignedaccordingtothecodingregionsequenceofLOC_Os06g49160generegisteredinGenBank.Thep30-GFPplasmidwasusedasatemplatetoamplifythetargetfragmentbypolymerasechainreaction.Afterpurification,therice160geneandplasmidvectorp30weredouble-cutwithXbaIandBamHI-GFP,thepurifiedproductisrecoveredandligatedintoarecombinantplasmidunderspecificconditions.Therecombinantplasmidisnamedp30-GFP-160.Aftertheligationiscompleted,doubleenzymedigestionisusedandtheelectrophoresispatternisusedtoconfirmwhethertheligationissuccessfulandthemethodofgenesequencingisusedVerifysequencechanges.Results：Accordingtotheelectrophoresispattern,thesizeoftheamplifiedtargetfragmentwasabout750bp,whichwasconsistentwiththeexpectedsize.Thebaitplasmidp30-GFP-160formedbythetargetedrecombinationofthetargetfragmentwiththep30-GFPvectorwasdigestedbyBamHⅠandXabⅠ.Theagarosegelelectrophoresispatternisbasicallyconsistentwithexpectations,andthegenesequencingresultsalsoshowthattheplasmidhasbeensuccessfullyconstructed.Conclusion：Therice160geneyeasttwo-hybridplasmidhasbeensuccessfullyconstructed,whichcanbeusedforsubsequentscreeningexperimentsofrelatedproteinsinrice,andestablishesatheoreticalandexperimentalbasisforthefurtheruseofyeasttwo-hybridtechnologytoexploretheinteractionbetweenproteins.KEYWORDS:LOC_Os06g49160;plasmidconstruction;yeasttwo-hybridsystem;p30-GFPvector

目录摘要 0ABSTRACT 21绪论 51.1酵母双杂交技术的概述 51.1.1酵母双杂交技术的发现和原理 51.1.2酵母双杂交技术的特点 61.1.3酵母双杂交技术的应用 81.3本实验的目的和意义 102材料与方法 112.1材料 112.1.1质粒和菌种 112.1.2主要试剂 112.1.3主要仪器 112.1.4主要试剂的配制 112.2方法 132.2.1转化大肠杆菌感受态细胞 132.2.2质粒扩大培养 132.2.3质粒提取 132.2.4PCR扩增 142.2.5PCR产物的鉴定和回收 152.2.6PCR产物以及载体双酶切 162.2.7目的片段与载体的连接 162.2.8连接产物的转化 172.2.9阳性克隆的筛选和鉴定 172.2.10重组质粒的双酶切鉴定 182.2.11重组质粒的测序鉴定 193结果与分析 203.1目的基因的PCR扩增 203.2诱饵质粒的酶切与测序鉴定 214结论与讨论 224.1结论 224.2讨论 22参考文献 24致谢 27符号说明 29附录 30

1绪论1.1酵母双杂交技术的概述早在上世纪末，生物学研究已经进入迈过了分子生物学，转而进入了更微观的后基因组时代。正因如此，关于蛋白质的研究也就顺理成章地成为了生物学研究的重中之重[1-3]。蛋白质无论是在动物植物还是细菌甚至是病毒的日常生长代谢过程中都扮演着重要的角色，并且每一种蛋白质并不是单独发挥作用，而是多种或者一类蛋白质共同调节机体的正常生命活动，如生长发育和新陈代谢等。现已有研究表明，病毒在增殖和复制的过程中不断调节和适应宿主的环境，DNA病毒和RNA病毒都编码大量的多功能的病毒蛋白与宿主细胞蛋白结合并修饰。越来越多的病毒学研究使得我们对病毒蛋白的研究结果、功能以及病毒与宿主的相互认识。但是，在现目前的生物学研究水平中，还有很多病毒与宿主的分子作用机制还不清楚。随着许多关于研究蛋白质组学的理论和技术不断成熟，研究蛋白质间相互作用的技术除了酵母双杂交技术之外，还有等离子共振技术和噬菌体展示技术等[4]。酵母双杂交技术由于其具有的多功能性、时效性和适应性等特点，该方法成为了研究蛋白质间相互作用的主要方法之一。该技术可以用做探索未知蛋白与已知蛋白之间的相互关系和识别基因的表达，所以酵母双杂交技术在医学上检验药物和细胞周期调控及其信号传导等方面都有重要作用。1.1.1酵母双杂交技术的发现和原理酵母双杂交技术通常是用来研究两组已知蛋白或者已知蛋白与未知蛋白之间相互作用的方法，该方法相对而言比较简单灵敏，而且可以通过建立文库的方法从而在整个基因组水平上验证蛋白质的相互作用[5,6]。该技术诞生于上世纪末，由美国纽约州里大学Fields教授和Song教授最先提出，他指出酵母双杂交技术的主要理论依据是真核细胞生物酵母转录因子GAL4（galactose-regulatedupstreampromoterelement,GAL）。1989年Fields等[7]建立了酵母双杂交体系，并根据起实验理论原理，将改技术着手于研究真核细胞内的DNAZ转录，该研究发现真核细胞存在着一种特殊的ATF，是由两个相对独立的结构域构成，并且其本身可与上游的转录起始位点结合。这两个结构域虽然在基因片段上所处的位置相互独立、在转录过程中体现的功能不同、彼此之间的表达也互不干扰，但是只要两者处于同一环境下就会激活并表达特定的基因，这种现象称为DNA特异性结合，而这两个结构域被称为激活结构域（AD）和结合结构域（BD）[8]。除了这两个结构域之外，还有一个被称为reportergene（报告基因）的概念，它包含一个可以与BD特异性结合的位点。由于酵母双杂交系统是研究蛋白质间作用的技术，所以在该系统中会出现两种蛋白质，一种是已知蛋白X会被克隆至DNA-BD载体中，表达出DNA-BD/X融合蛋白，也常常被称作“bait”(诱饵)；另一种蛋白质则是未知蛋白Y克隆至AD载体中，对应的也被称作是“prey”（猎物）。如果两个载体之间没有相互作用，BD和AD就不会与激活序列结合，相应的报告基因也就不会被激活和表达；相反，一旦蛋白质X和蛋白质Y之间存在相互作用，那么DNA-BD和AD就会被牵引导致它们之间的距离变小，恢复功能，激活下游报告基因中LacZ和HIS3的基因的表达[9]。由此，可以通过检测报告基因是否激活和表达来探究蛋白质间的相互作用，微观化为宏观，降低研究难度[10]。该技术从创立至今经过了数十年的不断改进和发展，通过改造AD和BD的载体、增加报告基因的数量等方法，在实验的准确性方面对比1989年系统建立之已有了很大提高，一方面提高了筛选的真阳性率、另一方面也降低了假阳性率。近年来许多实验结果表明，酵母双杂交技术的适用范围已不再仅仅是真核生物，原核生物甚至是病毒也同样适用，俨然成为了研究蛋白质组学的重要技术手段，同时也为探究蛋白互作及功能提供了技术支持和更大的可能性。1.1.2酵母双杂交技术的特点酵母双杂交技术作为在分析蛋白互作时的最常用手段之一，虽然具有效率高、适用范围大、操作简单、受环境影响较小、精确度高等诸多优点，但同时该技术也存在一定的局限性。由于酵母双杂交技术分析蛋白质间的相互作用是在细胞核内进行，但是甲基化、磷酸化、二硫键的合成和等对蛋白的加工却主要是在细胞质中的细胞器里完成，并且这些加工修饰都是蛋白质相互作用的关键所在，所以此类技术不能用于研究膜上的受体蛋白和胞外蛋白。酵母双杂交系统的优点（1）检测融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，免除了分离纯化蛋白质的操作，并且蛋白质保持天然的折叠状态，保证了蛋白质的活性，使得蛋白质间的互相作用更接近体内真实水平，所以能更加真实地反映蛋白质互作情况。（2）可通过检测基因表达产物的水平来反映蛋白质检测的结果，具有非常高的灵敏度，可用于检测水平可达结合常数1mmol/L。（3）在筛选cDNA文库时，酵母双杂交系统可得到编码互作蛋白的基因序列，相比于其他的体外检测蛋白质互作方法，避免了蛋白质抽提、分离纯化等步骤，极大得提高了效率简化了实验操作。酵母菌双杂交系统的局限性与改进（1）假阳性。假阳性是酵母双杂交过程中的最主要问题。由于某些蛋白质在没有bait和prey结合的情况下，本身就能激活报告基因的表达，酵母菌就会表达那些只与BD结构域结合而缺少AD结构域的基因，成为诱饵蛋白的自激活，从而表现出假阳性；另外某些蛋白质表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白作用形成结构稳定的复合物，引起报告基因的表达也会造成假阳性。针对上述问题，研究者们提出增加报告基因数量，且每个报告基因的上游调控区各不相同[11]和作严格的对照实验，对诱饵和靶蛋白分别单作单独激活报告基因的鉴定[12]等方法，另外将报告基因整合到染色体上，可以稳定基因表达水平，还能消除因为质粒拷贝数不同造成的假阳性，这方法都能显著降低假阳性产生的可能。（2）假阴性。所谓假阴性就是两个蛋白间本该发生互作反应，但是报告基因不表达或表达程度低于检测水平。主要有两个方面的原因：其一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题，但也应予以重视。[13]（3）核内反应。由于酵母双杂交必须在细胞核内进行，这就限制了该方法的适用对象，无法研究核外蛋白。为此，产生了SOS恢复系统[14],将互作蛋白的研究场所转移到胞浆中。（4）除此之外，转化率低下也是一个缺点。在建立基因文库和在文库中筛选时，蛋白质的转化率也至关重要。为此，在进行转化时选择共转化或者依次转化等方法可在一定程度上加快蛋白质的转化速度。[15]1.1.3酵母双杂交技术的应用酵母双杂交技术很大程度上在技术层面推动了蛋白质互作用研究的进步，加上后续的许多的实验结果表明该技术已经在很多不同的领域取得了重大突破。基于该技术的研究已经发现了大量未知蛋白种类和已知蛋白质的新功能，进而为建立健全已知的基因连锁图谱提供了技术支持，同时也为利用图谱发现新药物推动医药行业的发展保驾护航。由此可见，酵母双杂交技术应用于生物学研究领域的各个角落。（1）发现新蛋白质或者探究出蛋白质的新功能通过双杂交技术筛选动植物的不同细胞组织或不同时期的cDNA文库可以获得大量的新蛋白质。郑海舰等[16]采用双杂交技术，把牛肌肉细胞中产生的一种抑制素蛋白作为bait，成功从其cDNA文库中筛选出组成肌肉成分的新蛋白质，同时也为解释肌肉形成的原理供给了理论依据。Benoit等[17]利用酵母双杂交技术把一种名为Per-61的外周蛋白作为Bait，发现外周蛋白除了已知的功能之外还有一些特殊功能，比如调控细胞内细胞器的分布、参与跨细胞膜的囊泡转运、加工DNA和RNA、参与线粒体内重要的能量代谢等。Tham等[18]利用该技术发现埃及伊蚊（Aedesaegypti）的CPB1蛋白和登革病毒（denguevirus）的DENV2E蛋白具有相互作用，并且CPB1蛋白对病毒在伊蚊肠道细胞中的释放与积累有一定的调控作用，而另一方面埃及伊蚊作为登革病毒的主要传播媒介，这两种蛋白之间互作关系的发现很大程度上对控制登革病毒的传播有重要意义。Cao和Yan等[19]则是将目标放在了小麦上，利用酵母双杂交技术建立起小麦的cDNA文库，把影响小麦春化作用的TaVRN-A1作为诱饵蛋白，筛选出互作蛋白质TaSVP1和TaSOC1。除此之外，还有研究人员基于对蛋白质的已知功能的了解，致力于探索其新功能，对筛选出新的domain有重要帮助。（2）建立基因组蛋白连锁图谱另一方面，随着人们对生命科学研究的不断深入，现在对生物学的研究已经达到了更为精确的基因水平，另一方面基因文库也是愈发完善，研究人员发现了越来越多的具有调控生命活动功能的结构域和蛋白质。这些蛋白质是由DNA编码区上的可编码蛋白的基因转录而来，这些基因在功能和结构上相互之间也存在着某些联系，这对我们研究生物体正常活动以及调节具有重要意义[20,21]。酵母双杂交技术在建立基因组蛋白质连锁图谱上也有广泛应用。Waaijers等[22]使用数种已知蛋白质为bait，以人类基因组文库为对象进行酵母双杂交的筛选，同时人基因组蛋白质连锁图谱也因此而被建立起来。还确定了圆虫细胞中中约200个蛋白质之间的互作结构域，为完善蛋白质互作网络做出了突出贡献。Yuan等[23]绘制出了乙肝病毒HBX蛋白的互作图谱，发现了9个与HBX蛋白存在相互作用的新蛋白质，同时通过Pull-down技术还发现了与基孔肯雅热病毒有互作关系12个新蛋白并且通过双杂交技术还绘制了其基因网状图，这对两种病毒蛋白的发现对酵母双杂交技术在医疗药物方面的利用有重要意义。在没有酵母双杂交技术之前虽然已知弓形虫的微线体蛋白是一种具有调控功能的粘附蛋白质，但是具体就如何对弓形虫内进行调节的原理尚不清楚，但是随着酵母双杂交技术的发现，可以确定其MIC2蛋白是通过与蛋白A结构域结合来对其进行调控，阐明了其作用机理[24].Simona等[25]也是利用Pull-down和酵母双杂交两种技术相结合发现了一类作用于RNA3’末端的甲基转移酶在空间上具有两个互作蛋白，进而补充了植物RNAtransmethylase的图谱内容。Andrieu等[26]筛选出了226个会与HeatShockProteins27之间发生互作作用的蛋白质，并且通过绘制HSP27的蛋白网络图谱发现HSP27蛋白具有参与新细胞的生理过程的作用，包括但不限于修复和剪切DNA。由此可见酵母双杂交技术在建立和完善蛋白连锁图谱方面有重要作用，并且为进一步了解基因提供了技术基础。（3）筛选药物作用位点及药物对蛋白质之间相互作用的影响分子间相互作用可能导致疾病的产生，近几年有多项实验结果表明，治疗癌症和病毒类疾病效果最显著的是多肽类药物。可以用双杂交技术的筛选功能用于确定治疗所用的多肽类药物及其和致病因子的蛋白质间的相互关系，分析其发病机理，确定治疗所用的多肽类药物与致病蛋白间的关系，阻断它们的相互联系以达到治疗疾病的目的，目前该技术已广泛应用在药物筛选中。Waheed等[27]同样通过对细菌进行逆向双杂交得到了一种能影响TsG101蛋白与Gag蛋白结合的一种cyclin，阻断HIV-1在宿主细胞体内的出胞过程。另外经研究发现由登革热病毒引起发热、皮疹和出血等临床症状的致病机理与病毒的NS3拓扑异构酶、β-importin核内转运受体和NS5RNA聚合酶三者间的相互作用有关。秦咸蕴[28]利用双杂交技术筛选出了能抑制引发婴幼儿手口足病（HFMD）主要病原体肠道病毒Ev71活性的中药，为用药物治疗治疗肠道疾病方面做出了巨大贡献。（4）建立蛋白质互作网络许多蛋白质互相之间在功能上是有联系的，同时在机体进行生命活动时，这些蛋白质又彼此协调控制。随着人类基因组计划的不断进程与基因文库各方面的巨大进步，大量ORF产生，研究其功能成为了之后的主要任务，这些基因的功能通过其转录翻译产生的蛋白质表现出来，通过酵母双杂交技术，逐步走向自动化、高通量。郜尽[29]等在研究能对肝脏生命活动进行调控的转录因子时，用32个开放阅读框作为诱饵蛋白用于筛选其互作蛋白，绘制调节肝脏蛋白质的互作关系图谱。在2014年底的一期《Cell》中指出由加拿大高等研究院和美国哈佛医学院的科学家共同组成的一个研究小组并完成了一项名为“人类互作组（Humaninteractome）”，绘制出迄今为止人类历史上规模最大的基因组编码蛋白互作图谱，比以往的蛋白质互作图谱大4倍以上，其中描述了蛋白质间1.4万个直接相互作用。[30]1.3本实验的目的和意义酵母双杂交技术主要用于蛋白质相互作用的研究，本研究的目的是构建以p30-GFP为载体的杂交质粒，为进一步利用酵母双杂交筛选出细胞中蛋白质相互作用的蛋白质奠定基础。构建诱饵质粒是进行酵母双杂交筛选的必要条件，因此本实验为深入阐述LOC_Os06g49160与宿主之间的相互关系奠定了实验基础。

2材料与方法2.1材料2.1.1质粒和菌种大肠杆菌E.coliDH5α由本实验室保存P30-GFP载体购自Clontech公司2.1.2主要试剂限制性内切酶EcoRⅠ以及BamHⅠ内切酶T4DNA连接酶TaqDNA聚合酶引物Oligo(dT)16琼脂糖胰蛋白胨酵母浸粉NaClDNA纯化试剂盒DNAPurificationKit试剂盒Promega公司QuickpurePlasmidMinikit试剂盒大肠杆菌DH5α感受态细胞2.1.3主要仪器仪器名称生产厂家立式自动压力蒸汽灭菌器厦门致微仪器有限公司生化培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂振荡培养箱上海知楚仪器有限公司超净工作台常州普天仪器制造有限公司低温高速离心机艾本德生命科学公司PCR仪北京六一生物科技有限公司电泳仪北京六一生物科技有限公司凝胶成像系统北京六一生物科技有限公司电子天平奥豪斯仪器（常州）有限公司2.1.4主要试剂的配制（1）LB液体培养基：用天平称取5g蛋白胨，2.5g酵母提取物，5gNaCl，加入去离子水搅拌使其完全溶解，并用NaOH调节pH7.5，再次加入去离子水至总体积500mL，高压蒸汽灭菌（2）LB固体培养基：于LB液体培养基中加入琼脂粉（按照每升液体培养基12g琼脂粉的比例），放置于电炉上加热搅拌使琼脂粉完全溶解，高压蒸汽灭菌（3）50×TAE电泳缓冲液：称取242gTris和Na2EDTA·2H2O37.2g置于1L的烧杯中，加入57.1ml的冰醋酸充分溶解后加入去离子水定容至1L后，室温保存备用（5）1×TAE缓冲液：量取20mL50×TAE缓冲液，加入去离子水定容到1L（5）1%电泳凝胶：准确称量琼脂糖0.15g于锥形瓶中，量取17mL1×TAE缓冲液倒入锥形瓶轻轻摇晃均匀，至微波炉中加热，重复数次，至溶液变澄清，加热时间不宜过久防止溶液蒸干。待稍微放置冷却至手可以碰触的温度时加入1μLDNA核酸染料Gelred，摇晃混匀，倒入制胶板中，静置冷却25min（6）100mg/mL卡那霉素：准确量取1g卡那霉素粉末于锥形瓶中，加入少量去离子水充分溶解后，再加入去离子水定容到10mL，用高压灭菌后的0.22μm滤膜过滤灭菌，之后分装到2mL规格的无菌离心管中，在-20℃条件下保存备用，终浓度为100mg/mL（7）PBSbuffer：称取磷酸二氢钾（KH2PO4）0.27g,磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）1.42g，氯化钠（NaCl）8g，氯化钾（KCl）0.2g加入去离子水800ml充分搅拌溶解后，用浓盐酸调节pH至7.4，最后定容到1L（8）10×电泳缓冲储存液：10g十二烷基硫酸钠（SDS），30g三羟甲基氨基甲烷（Tris），144g甘氨酸，加超纯水至1L，调节pH8.3（9）50mg/ml盐酸壮观霉素：量取1g壮观霉素粉末，加入2mL去离子水溶解后，再加入去离子水定容到20mL，用高压灭菌后的0.22μm滤膜过滤灭菌，之后分装到2mL规格的无菌离心管中，-20℃保存，终浓度为50mg/mL（10）SolutionⅠ：50Mm/LEDTA（pH8.0）,1%葡萄糖，25Mm/LTris-HClpH8.0（11）SolutionⅡ：0.2mol/LNaOH（使用前用10mol/LNaOH母液稀释），1%SDS（12）SolutionⅢ：5mol/LKac60ml，冰醋酸11.5ml，ddH2O28.5ml，定容至100ml，高压蒸汽灭菌，终浓度为：K+3mol/L，Ac-5mol/L,pH4.8（必须现配现用）2.2方法2.2.1转化大肠杆菌感受态细胞在超净工作台，将2μL质粒将入到已预冷的100μL感受态细胞中，混合均匀之后在冰水浴在放置25min，再放入42℃恒温水浴锅中热激90s，再次放入冰水浴中2min，保证其完全冷却。向离心管中加入800μL的LB液体培养基，在220rpm37℃振荡培养1h，使其恢复表达抗生素的抗性标记基因。培养之后，在超净工作台上将菌液均匀涂布在含有卡那抗生素的LB平板上，37℃恒温箱倒置过夜培养12-16h。2.2.2质粒扩大培养经过37℃恒温过夜培养的阳性转化子的菌落颜色为白色，用牙签挑取8个生长良好的白色单菌落同时加入到5mLLB（含有Kan+）液体培养基中，放置于37℃恒温振荡培养箱中，220rpm振荡培养10h后，菌液呈肉眼可见的浑浊状态。2.2.3质粒提取经过过夜培养菌液质粒提取使用质粒抽提试剂盒，本实验使用的质粒提取试剂盒为QuickpurePlasmidMinikit试剂盒。在超净工作台中将每个样品都分批吸取到离心管中，共5mL菌液，在8000rpm的速度下离心2min，最后将菌体沉淀收集到同一个无菌离心管中，最后一次离心收集尽可能用移液枪将培养基吸干并丢弃。在（1）中含有菌体沉淀的离心管中加入250μLbufferPB，用枪头反复吹吸直至充分混匀。使用bufferPS和bufferPW之前要先检查是否存在沉淀，若有沉淀，需在37℃下恒温溶解后恢复室温再使用。柱平衡：向已装有收集管的吸附柱中加入200μLbufferPS。在13000rpm下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。将（1）中已经混有bufferPB的液体加入到放有收集管的吸附柱中，然后立即温和颠倒离心管10次以混匀溶液，室温静置2min，若同时提取多个样品，则选择每加入一管即可混匀，不可全部加入再混匀，13000rpm下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。加入500μLbufferPW（使用前请先检查是否加入无水乙醇）到吸附柱中，依旧是每加入一管混匀一管的方法，加入之后立即温和颠倒离心管10次使其充混合均匀。在13000rpm下离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。重复步骤（5）一遍。将空吸附柱和收集管再次放置在13000rpm转速下离心1min，此步目的是除去吸附柱和收集管中残留的乙醇，因为乙醇会对后续的实验造成影响，为确保下游实验能正常进行，可以将吸附柱开盖，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的乙醇。将吸附柱放到一个新的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40μLbufferEB，室温放置1min，在13000rpm下离心1min，收集DNA溶液，-20℃下保存备用。2.2.4PCR扩增以上步骤提取的质粒为模板进行PCR扩增反应，通过GenBank中搜索到水稻LOC_Os06g491601580bp，采用Primer5软件设计了一对可以特异扩增其实位点的引物，在LOC_Os06g49160上下游引物的5’分别加上XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点序列。LOC_Os06g49160引物序列上游引物F1:5’-ATGGTGGTGGCCATCGCT-3’下游引物F2:5’-GAATCCTTTGAGCTGACCACTCA-3’p30-GFP

质粒载体引物序列上流引物F3：5’-CGGAATTCCGATGGTGGTGGCCATCGCT-3’下流引物F4:5’-CGGGATCCCGGAATCCTTTGAGCTGACCACTCA-3’向无菌PCR管中加入下列试剂进行PCR扩增实验TemplateDNA2μL10×Taq酶扩增缓冲液5μLdNTP混合溶液（2.5mmol/L）2μLPrimerF2μLPrimerR2μLTaqDNA聚合酶1μLddH2O36μL总体积50μL将PCR管置于PCR仪上，盖好热盖，设定反应参数：95℃预变形5min，（95℃变性30s，62℃退火30s，70℃延伸1min）共35个循环，72℃保温10分钟，冷却至4℃。离心10s，将扩增产物置于-20℃冰箱保存备用。2.2.5PCR产物的鉴定和回收将PCR的扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析其扩增情况。预计扩增产物大小为750bp左右，并从TAE琼脂糖胶上切下目的片段的电泳条带，按照DNA纯化试剂盒上的说明书方法对PCR产物和p30-GFP空载体进行分离回收。回收步骤：直接向1.5ml离心管中加入90μlbuffer和PCR反应产物，振荡使其混合均匀；向离心管中加入1mL树脂，每隔1分钟振荡离心管，共三次；将没有拉杆的注射器筒（3mL）放置在纯化柱上，加入上述混合液，然后用拉杆慢慢将混合液推进纯化柱内；卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加入2mL的异丙醇，然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5mL离心管上，10000rpm离心2min，以干燥树脂；再将纯化柱装在一个新的1.5mL离心管上，加入30μL的ddH2O冲液，1min后再10000rpm离心20s，溶出DNA片段；移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液取出部分用于酶切，其余在-20℃下保存备用2.2.6PCR产物以及载体双酶切（1）反应体系1和2：1.回收的PCR产物：7μL10×限制酶buffer：2.5μL0.1%B5A：5μL无菌水：32.5μLXbaI（10000U/ml）：1.5μLBamHI（10000U/ml）：1.5μL总体积：50μL2.p30-GFP空载体：20μL10×限制酶buffer：2.5μL0.1%B5A：5μL无菌水：19.5μLXbaI（10000U/ml）：1.5μLBamHI（10000U/ml）：1.5μL总体积：50μL（2）将以上体系液体加入离心管中混匀后，在5000rpm转速下离心3s，使液体都聚集在管底，置于37℃水浴锅中酶切4h，再转移到65℃条件下保存15min使内切酶失活，终止酶切反应；（3）将上述酶切产物与6×缓冲液混合，进行1%琼脂糖凝胶电泳，切下目的条带，用DNA纯化试剂盒分别纯化回收，并用于下一步的连接反应。2.2.7目的片段与载体的连接PCR产物与载体p30-GFP均进行双酶切后，可将PCR产物连接到p30-GFP的XbaI/BamHI位点之间cDNA片段与p30-GFP载体连接体系：T4DNA连接酶（2U/ml）0.4μLT4DNA连接酶缓冲液（10×Buffer）1μLddH2O4.2μL载体DNA（150ng/ml）4μL目的片段（60ng/ml）0.4μL总体积10μL混匀后，在16℃条件下反应过夜。其中目的片段的摩尔浓度应该为p30-GFP摩尔浓度的3倍以上，连接产物用于下一步感受态细胞的转化。2.2.8连接产物的转化将5μL连接产物加入到200μL感受态大肠杆菌DH5α悬液中（始终在冰浴中），温和地混合均匀，先置于冰水浴保存30min，共计2根试管。再取另一支只加入2μl载体p30-GFP，为阴性对照管，分别编号为1、2、3号，同样加入200μl菌悬液混合后冰水浴保存30min；将3支试管都放入事先预热到42℃恒温水浴锅中热激90秒，然后迅速放置冰浴中冷却5分钟；向3支试管中都加入700μLLB培养基并混匀，放置于37℃的恒温摇床中（200rpm）培养30分钟；将1号和2号试管中的混合物经离心后去除上层培养基，将底层沉淀涂布用已灭菌的玻璃涂布器均匀涂布，转移到含盐酸壮观霉素的LB琼脂培养基平板上，3号管直接移取30μl同样进行涂布，待到菌液已被培养基完全吸收，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养过夜。2.2.9阳性克隆的筛选和鉴定从上一步培养的平板上挑取5个阳性克隆，按照碱裂解法得到少量的质粒，通过电泳初步鉴定出阳性克隆载体。其中序列正确的重组质粒保存备用从培养基平板上挑取一个白色单菌落的转化子，接种在含有盐酸壮观霉素浓度为50mg/ml的LB培养基中，选择其中能正常生长具有壮观霉素抗性的菌种，置于37℃的摇床150rpm振荡过夜培养；移取1.5ml菌液于EP管中，在6000rpm转速下高速离心2分钟，弃上清液，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽，使细胞尽可能干燥；向EP管中加入200μLsolutionⅠ溶液，在漩涡振荡器上振荡20秒使其充分混匀；再向其中加入新配置的400μLsolutionⅡ溶液，盖紧管口，轻轻颠倒数次使其混匀并使细胞裂解，在冰浴中放置3分钟；加入300μL预冷的solutionⅢ溶液，再次振荡颠倒混匀，使沉淀混匀，冰浴5分钟；于12000rpm离心10分钟，转移上清液700μL于另一干净的EP管中，弃沉淀；加入700μL的酚：氯仿：异丙醇（25:24:1），振荡30秒混匀，于室温下放置10分钟；再次放置在离心机中，于12000rpm离心5分钟，提取上清液（约500μl）于另一干净EP管中；加入2倍体积无水乙醇振荡混匀后，在-20℃下放置15min；于12000rpm离心10分钟，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，用70%的乙醇洗涤两遍沉淀；将离心管放置室温下使其自然干燥，待乙醇挥发后，将沉淀溶于20μlTE缓冲液中，提取出来的质粒置于-20℃保存备用。2.2.10重组质粒的双酶切鉴定将已提取的重组质粒按照下列体系加样，并放置于37℃恒温水浴锅中酶切一个小时。待反应结束后，取出酶切后的重组质粒、p30-GFP、目的片段各10μL在1%琼脂糖凝胶用110V电泳25min，在凝胶成像系统下观察结果，并保存电泳图。重组质粒p30-GFP-1605μLXbaⅠ0.5μLBamHⅠ0.5μL10×buffer缓冲液2.0μL灭菌ddH2O12μL总体积20μL2.2.11重组质粒的测序鉴定构建的重组质粒经过双酶切鉴定后和预期结果相符合的质粒送与基因科技有限公司进行测序。

3结果与分析3.1目的基因的PCR扩增以经过QuickpurePlasmidMinikit质粒提取盒提取出来的质粒为模板进行PCR扩增，用2kbDNAladder为maker进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3-1所示，显示PCR产物大小在500-1000bp之间出现清晰条带，与与其片段大小（750bp）一致。1000bp→500bp→1000bp→500bp→图3-1目的基因的PCR扩增电泳图Fig3-1TargetgenebyPCRM：DL2000DNA相对分子质量；1,2,3,4,5,6：目的基因；7：阴性对照M:DL2000DNAMaker；1,2,3,4,5,6：Targetgene；7：Negativecontrol3.2诱饵质粒的双酶切与测序鉴定将纯化回收后的连接产物重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，筛选得到阳性转化子，用碱裂解法操作提取扩增的诱饵质粒，对其使用XbaⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定，并进行琼脂糖电泳分析从电泳图谱3-2可以看到在750bp左右有一条亮带，与预期大小一致。对诱饵质粒进行基因测序，结果显示与GenBank公布的蛋白基因序列（）同源性为100%。

4结论与讨论4.1结论本实验成功构建了诱饵质粒p30-GFP-160，将重组质粒转入到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，成功筛选出具有壮观霉素抗性的阳性克隆菌，进一步通过双酶切电泳和基因测序验证了质粒的正确性，并且符合酵母双杂交质粒的构建要求。4.2讨论目前酵母双杂交系统是使用较为广泛的用于研究两种或多种蛋白质之间功能与结构关系的一种实验方法，原理是在酵母菌的细胞内模拟出在细胞环境内两种蛋白质间的相互作用，通常情况下的作用是研究或者验证已知蛋白质间的关系、寻找与已知蛋白有联系并且具有相互作用的未知蛋白、获取新基因等，同时在进一步弄清细胞的信号传导机制、细胞生长衰老与凋亡和癌基因等相关细胞生物学的研究也具有重要作用。双杂交系统是以酵母菌转录激活因子GAL4的特性理论为支撑建立的，GAL4包含两个结构域，分别是结合结构域（N末端结构域或者DBD）和激活结构域（C末端结构域或者AD），它们在功能和结构上都相互独立，只有当两者处于同一细胞内时，相互之间才可以通过建立空间联系来激活转录因子GAL4，单独的任意一种结构域都无法激活GAL4，GAL4能识别基因启动子上游激活序列（UASg）的一段17bp的序列：5'-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3'（R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示任意脱氧核苷酸），同时激活下游半乳糖苷酶相关基因的转录。本实验构建水稻160基因双杂交质粒载体，为找到与水稻160基因相互作用的蛋白质奠定了基础。首先需要将目的片段导入p30-GFP的多克隆位点从而得到诱饵重组质粒p30-GFP-160。利用分子克隆技术，目的片段事先设计的特异性引物中含有与质粒p30-GFP相对性的限制性内切酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，通过聚合酶链式反应扩增含有酶切位点的目的片段的cDNA产物，回收产物，再用BamHⅠ和XabⅠ限制性内切酶对目的片段和载体p30-GFP进行双酶切，回收片段并连接，连接产物导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，利用p30-GFP质粒所带的壮观霉素抗性接种在含有该抗生素的培养基中进行培养，从而筛选出具有抗性的阳性克隆菌，用碱提取法提取出克隆菌中的重组质粒，进行双酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳验证目的片段的大小是否与预期值相符合，并送往基因技术公司测序进一步验证重组质粒的序列是否正确。至此，诱饵质粒p30-GFP-160构建成功，筛选出其互作蛋白创造了实验条件。

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