23-丁二醇对细胞周期的影响

2，3-丁二醇对细胞周期的影响 概述：了解白酒酒体中各风味物质对人体健康的影响，提高白酒酒体中功能活性物质的含量，降低酒体中有害成分已成为今后研究的一个重要方向。1绪论1.1研究背景世界六大蒸馏酒之一——白酒，是中国独有的蒸馏酒。从古至今，中国白酒因其独特浓郁的风味受到中国乃至世界人民的喜爱。随着人民日益增长的物质文化需要到人民日益增长的美好生活需要的转变，健康在美好生活中的地位不容忽视，越来越多的人开始关注白酒对人体健康的影响。传统认为白酒有活血通脉、增进食欲、消除疲劳等功效。研究表明饮用少量低度白酒可以扩张小血管，可使血液中的含糖量降低,促进血液循环，延缓胆固醇等脂质在血管壁的沉积，对循环系统及心脑血管有利。然而白酒中含有大量具有独特风味的微量物质，这些物质虽然在白酒总体中含量较低，但种类繁多、成分复杂，因此需要大量的科学研究才能最终得出白酒对人体健康的影响。原发性肝癌（primacylivercancer，PLC）作为全球范围内较为常见的恶性肿瘤疾病之一，在我国有着较高的临床发病率，且呈逐年上升趋势房达,赵乾,杜宁,等.肝癌放,射介入治疗患者辐射剂量的分析［J］.首都医科大学学报，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.。我国PLC的主要危险因素是乙型肝炎病毒（HBV）的感染，随着酒精性肝病成为第二肝病病因，仅次于病毒性肝炎，饮酒与PLC的关系也越来越受到重视孙晓艳，王炳元.饮酒与肝癌[J].现代医药卫生，2007，23（7）：1007.。Meta分析结合不同研究结果合并后得出计饮酒的合并OR值为1.87，表明饮酒是原发性肝癌的危险因素，可增加患原发性肝癌的风险李辉，刘诗义，刘健，等.饮酒和HBsAg与肝细胞肝癌的关联性研究[J].医药论坛杂志，2015，36（5）：12-13.。房达,赵乾,杜宁,等.肝癌放,射介入治疗患者辐射剂量的分析［J］.首都医科大学学报，2020，41（3）：454-457.DOI：10.3969/j.issn.1006-7795.2020.03.024.孙晓艳，王炳元.饮酒与肝癌[J].现代医药卫生，2007，23（7）：1007.李辉，刘诗义，刘健，等.饮酒和HBsAg与肝细胞肝癌的关联性研究[J].医药论坛杂志，2015，36（5）：12-13.传统上人们经常将白酒与有害健康以及酗酒等问题相联系，而往往忽略了白酒复杂酒体体系中对健康有益并可以减轻酒精伤害的另一部分微量成分徐岩,范文来,葛向阳,等.科学认识中国白酒中的生物活性成分[J].酿酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.。国内外的研究证实了酒类饮料或白酒具有一定的保健作用。Petrick等PETRICK徐岩,范文来,葛向阳,等.科学认识中国白酒中的生物活性成分[J].酿酒科技,2013(9):1-6.DOI:10.3969/j.issn.1001-9286.2013.09.001.PETRICKJL,CAMPBELLPT,KOSHIOLJ,etal.Tobacco,alcoholuseandriskofhepatocellularcarcinomaandintrahepaticcholangiocarcinoma:thelivercancerpoolingproject[J].BritishJournalofCancer,2018,118(7):1005-1012.DOI:10.1038/s41416018-0007-z.1.2白酒中微量物质的研究进展：魏梦娇魏梦娇.饮用酒暴露诱导小鼠肝肾组织的毒性效应及其分子机制[D].山西大学,2020.在研究饮用酒暴露诱导小鼠肝肾组织毒性中，引用在相同酒精度数下，单纯给予酒精对大鼠肝脏的损伤程度要比饮用酒的严重，表明饮用酒内的某些成分可以对抗乙醇对肝脏的损伤,并且通过研究重建小鼠灌胃模型（微量有机组分含量提高的饮用酒干预模型）通过分子机制验证了饮用酒中这些微量有组分（乙酸、乙酸乙酯、乳酸和乳酸乙酯）可以减轻乙醇诱导肝损伤。因此可以推论出白酒中其他的微量成分也具有研究价值。魏梦娇.饮用酒暴露诱导小鼠肝肾组织的毒性效应及其分子机制[D].山西大学,2020.白酒中很多微量成分对人体有益，有机酸：没食子酸可以防治过敏疾病KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.；阿魏酸有很好的抗氧化能力，具有清除超氧阴离子自由基和抑制脂质过氧化的作用MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.。KIMSH,JUNCD,SUKK,etal.Gallicacidinhibitshistaminereleaseandpro-inflammatorycytokineproductioninmastcells[J].ToxicologicalSciences,2006,91(1):123-131.DOI:10.1093/toxsci/kfj063.MARIMUTHUS,SUDHEERAR,MENONVP.Ferulicacid:therapeuticpotentialthroughitsantioxidantproperty[J].JournalofClinicalBiochemistry&Nutrition,2007,40(2):92-100.DOI:10.3164/jcbn.40.92.乙酸乙酯可以治疗乳腺癌张静,单保恩,刘刚叁,等.香加皮乙酸乙酯提取物诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究[J].肿瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.、舒张血管蒋惠娣,王玲飞,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相关机制[J].中国病理生理杂志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.；丁酸乙酯可以稳定人的情绪张静,单保恩,刘刚叁,等.香加皮乙酸乙酯提取物诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的研究[J].肿瘤,2006,26(5):418-421;439.DOI:10.3781/j.issn.1000-7431.2006.05.003.蒋惠娣,王玲飞,周新妹,等.杭白菊乙酸乙酯提取物的舒血管作用及相关机制[J].中国病理生理杂志,2005,21(2):334-338.DOI:10.3321/j.issn:1000-4718.2005.02.029.AZABAN,MEHTADV,CHESEBROJE,etal.Ethylbutyrate,avalproate-likecompound,exhibitsinositol-depletingeffects:apotentialmood-stabilizingdrug[J].LifeSciences,2009,84(1/2):3844.DOI:10.1016/j.lfs.2008.10.016.萜烯物质种类丰富，而且大部分物质如：β-石竹烯、茴香脑、榄香烯和β-桉叶油醇等萜烯类物质具有抗氧化DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.、抗癌CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.等生理学功能，同时也能改善白酒风味。DAHHAMSS,TABANAYM,IQBALMA,etal.Theanticancer,antioxidantandantimicrobialpropertiesofthesesquiterpeneβ-caryophyllenefromtheessentialoilofAquilariacrassna[J].Molecules,2015,20(7):11808-11829.DOI:10.3390/molecules200711808.CHAINYGBN,MANNASK,CHATURVEDIMM.Anetholeblocksbothearlyandlatecellularresponsestransducedbytumornecrosisfactor:effectonNF-kappaB,AP-1,JNK,MAPKKandapoptosis[J].Oncogene,2000,19(25):2943-2950.DOI:10.1038/sj.onc.1203614.LIQQ,WANGGD,HUANGFR,etal.Antineoplasticeffectofbeta-elemeneonprostatecancercellsandothertypesofsolidtumourcells[J].JournalofPharmacyandPharmacology,2010,62(8):10181027.DOI:10.1111/j.2042-7158.2010.01135.x.MAEL,LIYC,TSUNEKIH,etal.Beta-eudesmolsuppressestumourgrowththroughinhibitionoftumourneovascularisationandtumourcellproliferation[J].JournalofAsianNaturalProductsResearch,2008,10(1/2):159-167.DOI:10.1080/10286020701394332.丰富的吡嗪物质很多都是有益成分，如：2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪等均具有抗氧化功能孙惜时,李文华,李荣,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪类成分的抗氧化活性[J].酿酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.，而四甲基吡嗪则是白酒中最为主要的吡嗪物质，它是中药川穹的主要成分，具有抑制肿瘤FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.孙惜时,李文华,李荣,等.芝麻香型白酒中硫化物和吡嗪类成分的抗氧化活性[J].酿酒,2013,40(4):57-60.DOI:10.3969/j.issn.1002-8110.2013.04.017.FUYS,LINYY,CHOUSC,etal.Tetramethylpyrazineinhibitsactivitiesofgliomacellsandglutamateneuro-excitotoxicity:potentialtherapeuticapplicationfortreatmentofgliomas[J].Neuro-Oncology,2008,10(2):139-152.DOI:10.1215/15228517-2007-051.当前报道的白酒中微量成分物质较多，仅定性物质就包括酸类、酯类、醇类、醛类、吡嗪、萜烯等2000多种，其中不乏有多种有益健康的微量成分YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.。目前对白酒微量成分的认识还在初级阶段，还有很多问题需要进行深入研究。YAOF,YIB,SHENC,etal.ChemicalanalysisoftheChineseliquorLuzhoulaojiaobycomprehensivetwo-dimensionalgaschromatography/time-of-flightmassspectrometry[J].ScientificReports,2015,5:9553.DOI:10.1038/srep09553.1.32,3-丁二醇研究现状：2，3-丁二醇(2,3-Butanedio1)是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域，常温下是一种无色无味的透明液体戴建英,孙亚琴,孙丽慧,等.生物基化学品2,3-丁二醇的研究进展[J].过程工程学报,2010,10(01):200-208.。戴建英,孙亚琴,孙丽慧,等.生物基化学品2,3-丁二醇的研究进展[J].过程工程学报,2010,10(01):200-208.白酒中呈味物质2，3-丁二醇的形成，主要是在糖化发酵的后期形成，在这个时期，温度缓慢降低，糖化发酵作用较弱，但却是众多香味物质生成的时期。2，3-丁二醇是二元醇，但它也具有酮的性质，并有助香作用，在我国名优白酒中，含量均较高。2，3-丁二醇主要由多粘菌或赛氏杆菌等发酵而生成陆寿鹏.酿造工艺[M].2002.陆寿鹏.酿造工艺[M].2002.C6H12O6CH3CHOHCHOHCH3+2CO2+H2尹礼国尹礼国,冯学愚,许德富,.五粮浓香型白酒黄水微量物质分析及应用探讨[J].酿酒科技,2014(04):83-85.等采用毛细管柱气相色谱内标法分析黄水样品中66种微量成分并与优质白酒的微量成分进行了对比分析，其中黄水中含量较高的醇类有6种，其中2,3-丁二醇占总量的87.8%，含量达1.1212g/L，并且优质白酒中2,3-丁二醇含量也相对较高，含量达0.0384g/L，占第24位。尹礼国,冯学愚,许德富,.五粮浓香型白酒黄水微量物质分析及应用探讨[J].酿酒科技,2014(04):83-85.2,3-丁二醇属多元醇，具有甜味几天和助甜基团，也是白酒中甜味的主要来源。泸香型白酒由于甘油、双乙酰、2,3-丁二醇含量较高，它们与己酸乙酯配合得当时，构成泸香型酒的典型香、甜风味刁治民，魏克家，陈占全等.农业微生物工程学[M].2007.刁治民，魏克家，陈占全等.农业微生物工程学[M].2007.2,3-丁二醇在馊香型调味酒（验收后的合格酒，经勾兑成比较全面的基础酒，在香味或口味的某些方面还有不足。需要通过调味来加以弥补）中的大量存在，可以解决基础酒的后涩、苦、后味微杂、香味单调等缺陷韩珍琼主编.酿造食品加工技术[M].2009.韩珍琼主编.酿造食品加工技术[M].2009.因此探究2,3-丁二醇的影响是有必要的。1.4研究目的及意义：虽然饮用酒对动物肝脏影响有一定的研究，但对白酒中微量物质，上千种微量成分以及杂糅在一起的对人体的综合效应的研究较少，甚至对2，3-丁二醇在食品健康领域方面的探究少之又少，2，3-丁二醇对肝脏细胞的影响尚不明确。因此提出本课题，其研究的意义在于：用HepG2肝癌细胞，通过检测氧化应激、细胞衰老、凋亡等反应，来看出不同浓度的2，3-丁二醇对肝脏组织的效应。初步探究2，3-丁二醇对人体健康是否有益。不仅是2，3-丁二醇，白酒中还有很多重要组分需要一一探究并且还要探究复合组分对人体的错综复杂的影响，最终在对研究白酒方面提供科学的依据。2材料与方法2.1仪器表2-1仪器Table2-1Apparatus名称型号生产厂家CO2培养箱Galaxy170RNewBrunswickScientific倒置荧光显微镜IX71OlympusCorporation生物安全柜AirstreamA2型EscoMicroPteLtd电热鼓风干燥箱GZX-9146MBE上海博迅实业有限公司小型离心机Centrifuge5418Eppendorf高性能台式离心机X1RThermoFisher超低温冰箱ThermoScientific核酸蛋白微量检测仪SpectraMax190MolecularDevices超声波细胞破碎仪JY88-IIN上海沪析实业有限公司摇床SLK-O3000-S混匀仪MXW-20DL杭州齐威有限公司电热恒温水浴锅DK-98-II天津泰斯特仪器有限公司冰箱BCD-183KF1TCL家用电器有限公司电泳仪Bio-Rad电子天平AX124ZH/EOHAUS2.2试剂及药品表2-2试剂及药品Table2-2ReagentsandMedicines名称生产厂家DMEM高糖培养基吉诺生物医药胎牛血清（FBS）浙江天杭生物科技青-链霉素（双抗）上海源培生物科技2，3-丁二醇上海易恩化学铁氰化钾上海易恩化学X-Gal索莱宝生物科技5-溴-2-脱氧尿苷武汉科瑞生物技术活性氧荧光探针（DFCH-DA）DNA提取酚索莱宝生物科技ProteinaseK北京天根生化溴化乙啶（EB）二甲亚砜（DMSO）噻唑蓝（MTT）二甲双胍维生素C其他试剂：乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（tris碱）、冰乙酸、柠檬酸、H3PO4、K4Fe(CN)6、MgCl2、NaCl、氯仿、异戊醇、乙醇、甲醛、戊二醛、KH2PO4、Na2HPO4、KCl试剂配置：50xTAE：tris碱（三羟甲基氨基甲烷）12.1g、Na2-EDTA（乙二胺四乙酸二钠）1.86g、冰乙酸2.855mL、去离子水40ml，最终定容至50ml，待用时再稀释至1xTAEX-Gal染色液：K3Fe(CN)6（100mmol/L）；K4Fe(CN)6（100mmol/L）；X-Gal（20mg/L）；MgCl2（1mol/L）；NaCl（5mol/L）；柠檬酸—磷酸缓冲液（柠檬酸0.1mol/L、磷酸0.2mol/L）磷酸缓冲液（PBS）：KCl（2.7mM）、Na2HPO4（8.1mM）、KH2PO4(1.8mM)、NaCl(137mM)2.3实验方法：2.3.1实验分组2.3.2细胞培养2.3.2.1细胞复苏快速从-80℃超低温冰箱里取出冻存管，快速放进37℃水浴锅缓慢摇晃使细胞解冻（冻存管的封口膜不要破裂，防止污染），使用移液枪将1mL细胞全部吸出至10mL无菌EP管，补加9mL基础培养基稀释，分装至1.5mL的无菌EP管中，离心（1000rpm、5min）使细胞沉淀，弃掉上清液。用马氏管吸取9mL左右基础培养基，10%胎牛血清，50μl双抗，轻轻混匀，用吸管将细胞移至培养瓶。平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于培养箱培养（37℃、5%CO2），培养24小时后，显微镜观察细胞（贴壁细胞）贴壁后，小心更换培养基，继续培养，根据不同细胞的生长状态进行传代培养。2.3.2.2细胞传代细胞长满90%-100%即可传代，打开培养瓶，弃培养基。加入1mLPBS，润洗细胞，重复3次，弃PBS。加入4mL基础培养基，用无菌吸管小心吹打贴壁细胞或者用胰蛋白酶消化细胞使细胞脱落。移液枪转移1mL脱落的细胞至新的培养瓶，培养瓶中补加8mL基础培养基，10%胎牛血清，50μL双抗，小心封口，平躺放置培养瓶，8字形混匀后，置于培养箱培养（37℃、5%CO2）2.3.2.3细胞换液：每两日在显微镜下观察细胞生长状态，待长满视野80％左右即可进行细胞换液，取出培养瓶，弃培养瓶中培养基，马氏管吸取9mL培养基，根据之前生长情况，适量增加或减少胎牛血清（按经验，后传代一般为300~600μL），加入50μL双抗8字形混匀后，置于培养箱培养（37℃、5%CO2）。2.3.3细胞形态观察:2.3.4对β-半乳糖苷酶底物染色法研究细胞衰老：取Hepg2细胞（24h、48h）800μL细胞液到1.5mL的ep管中，离心（1500rpm5min）得到细胞沉淀，去除上清液，加500μLPBS到ep管中，用移液枪吹打混匀，取200μL到盖玻片上，加固定液（2％甲醛）200μL固定10min，用移液枪吸取300μLPBS冲一次，可适当再次用150μL再冲一次，用X-Gal染色液进行染色，充分盖住细胞，染色1h，在染色过程中放在超净工作台开风机尽量吹干相当水分，染色结束弃染液，用少量灭菌水冲开染液，不宜过多容易冲走细胞。统计结果，蓝染为阳性，随机视野取500细胞，统计阳性细胞百分率。2.3.5通过测定Caspase-8活性来研究2，3-丁二醇对细胞凋亡的影响：取Hepg2细胞（24h、8h）1000g、5分钟收集细胞,吸尽上清。每2~10×106细胞加50~100μL裂解液，放在旋涡混匀器上震荡裂解，冰浴10分钟，再次震荡。4℃、12,000g、10分钟取上清测定。按表设置96孔板反应体系。底物最后加入以使各管反应起始时间相同,设置不加样品的空白对照管。置于37℃饱和温度,5%CO2培养箱中孵育2h，根据标准曲线计算其含量。Caspase活性增加的百分比=实验处理组OD/实验对照组OD*100%反应体系：无样品空白对照（低酶）活性样品反应缓冲液μL9560待测样品μL—35底物μL55总体积μL1001002.3.6DNAladder测定：1.提取细胞中DNA（酚氯仿法）：每组取1mL到EP管中，超声波破碎细胞（250w15min每破碎3s间隔5s）；Ep管中加入10μL蛋白酶K，放入摇床（56℃1h）；加入等体积tris饱和酚（DNA提取酚）500μL，摇匀10min，离心（12000rpm7min4℃）[上层DNA中层蛋白质下层有机质]；吸取上层液体加入新离心管。配置混合液（tris饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）；加入混合液450μL，摇匀10min离心（12000rpm7min4℃）；取上清到新离心管，加等体积（氯仿：异戊醇=24:1）混合液400μL；离心（12000rpm7min4℃）；取上清到新离心管，加2.5倍100％酒精（-20℃预冷）；-20℃过夜取出离心（12000rpm7min4℃）；弃上清留50μL，留白色沉淀（DNA），待酒精挥发1h，加灭菌水溶解放入2.琼脂糖凝胶电泳制备琼脂糖凝胶：用胶带纸将洗净干燥的电泳凝胶床的两端开口封号，形成一个胶膜，平放在工作台上。配置50xTAE，使用时稀释到1xTAE，加1％琼脂糖，放入微波炉内加热至溶液澄清（100度），取出摇动使琼脂糖尽快溶解。溶化的琼脂糖溶液冷却至不太烫手时，加入溴化乙啶（EB），使其终浓度为0.5μg/ml，充分摇匀；在胶膜放置好梳子后，将凝胶倒入板中等待凝固进行电泳：使用前加入1.5L1xTAE溶液到泳槽，使液面高出凝胶表面1-2mm，将标记物及样品与上样缓冲液混合，并以依次加入样品孔