细胞生物学讲课课件

7.5程序性细胞死亡

讲授内容

一、概述二、细胞凋亡的生物学特征三、细胞凋亡过程与调控四、细胞凋亡的发生机制五、细胞凋亡与疾病学习要求掌握细胞凋亡的概念、生物学意义。掌握细胞凋亡的过程及细胞凋亡与坏死的差别。熟悉细胞凋亡的主要变化。熟悉细胞凋亡的调控。熟悉细胞凋亡与常见疾病的关系。了解细胞凋亡在疾病防治中的意义。细胞凋亡:细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,结束其生命的生理性死亡，是受基因严格调控的细胞自杀现象.凋亡过程中，细胞骨架蛋白分解—细胞和细胞器浓缩而不裂解—染色体DNA断裂和形成凋亡小体—细胞内含物不外泄，不引起炎症反应。最后凋亡小体被巨噬细胞识别和吞噬。细胞坏死（necrosis）是在各种致病因素（如缺氧、物理、化学和生物学因素）的剧烈刺激下的病理性死亡。

其特点是:引起死亡的因素剧烈，死亡迅速。能量代谢下降—膜通透性增加—细胞水肿—细胞器破裂，细胞溶解，DNA不断裂—内含物释放—引起炎症反应。细胞凋亡与坏死的比较1衰老的概念（附）衰老(senescing，aging)：是机体在退化时期生理功能下降和紊乱的综合表现，是不可逆的生命过程。人的衰老与细胞的衰老相关联。现代人类面临着3种衰老：生理性衰老；心理性衰老病理性衰老；心理负担和压力可结合保健防病加以控制是生命过程的必然Hayflick界限1961年，Hayflick首次报道了体外培养的人的成纤维细胞具有增殖分裂的极限。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是Hayflick界限**。个体衰老与细胞衰老老人会出现

皱纹、老人色斑、白头发皮肤干燥、发皱头发变白老人斑饮食减少细胞水分减少，体积减小细胞内的酶活性降低细胞内色素的累积细胞膜通透性功能改变早老症儿童与正常儿童的比较细胞的凋亡由基因所决定的细胞自动结束生命的过程，就叫细胞凋亡细胞凋亡受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常叫做细胞编程性死亡2002年，英国科学家悉尼·布雷诺尔、约翰·苏尔斯顿和美国科学家罗伯特·霍维茨。他们为研究器官发育和程序性细胞死亡过程中的基因调节作用作出了重大贡献。SydneyBrenner

H.RobertHorvitzJohnE.Sulston

细胞凋亡叶子的离开不是风的追求也不是树的不挽留而是命运的安排自然的选择该来的会来该走的会走有时候离开并不意味着结束而是－另一种开始！发生在我们身边的细胞凋亡二、细胞凋亡的生物学特征（一）细胞凋亡的形态学特征（二）细胞凋亡的生化特征（三）细胞凋亡的生理意义（四）细胞凋亡的检测方法（一）细胞凋亡的形态学特征细胞：首先变圆，体积缩小，与邻近细胞的连接丧失，失去微绒毛，胞浆浓缩。细胞核的变化：胞核内染色质浓缩形成密集颗粒呈帽状〈或新月形)，位于核被膜下。核被膜下核纤层(nuclearlamina)分解，随后细胞核内染色质固缩为不均一点状结构。细胞质和细胞膜：相邻细胞间连接复合体普遍消失，其他细胞膜特有结构如微绒毛等亦随之消失。此时，细胞膜结构仍保持完整。空泡化固缩出芽边集凋亡小体凋亡细胞的形态学特征：核酸内切酶活化与DNA电泳呈梯子状改变是Apoptosis的生物化学标志。核酸内切酶在核小体连接处将DNA链切断，从而最终产生寡聚核小体。这些寡聚核小体的大小均是DNA长度为180-200个碱基对(bp)的倍数，因此用琼脂糖凝胶电泳测定细胞DNA时出现特征性的“梯状”（ladder）带纹。（三）细胞凋亡的生理意义

1维持组织器官细胞类型和细胞总量的基本平衡：清除衰老损伤的细胞：皮肤、粘膜细胞的更新等。2在胚胎发育中起重要作用a手指和脚趾的形成等。b

大脑神经元之间形成连接时多余的神经细胞通过凋亡清除掉。c

在淋巴细胞发育成熟中起重要作用。d

心脏发育过程中左右心室、房的形成以及左右心室的厚度，通过细胞凋亡调节。3细胞凋亡异常可引起肿瘤和神经退行性病变等疾病。（四）细胞凋亡的检测方法◆形态学观测：染色法、透射和扫描电镜观察◆DNA电泳：DNA片段就呈现出梯状条带◆TUNEL测定法:即DNA断裂的原位末端标记法◆彗星电泳法（cometassay）◆流式细胞分析根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞，同时又能观察细胞的周期状态。一、细胞凋亡的形态学检测根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。1、光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker形成大小为180～200bp整倍性的DNA梯状条带；2、DNA电泳4、彗星电泳法5、流式细胞分析凋亡细胞形成的DNA降解片段，在电场中泳动速度快，使细胞核产生彗星式的图案；根据凋亡细胞DNA断裂和丢失，采用碘化丙啶使DNA产生激发荧光，用流式细胞仪检出凋亡的亚二倍体细胞。3、TUNEL测定法即DNA断裂的原位末端标记法：凋亡细胞核中DNA产生3’-OH末端，可用原位缺口翻译或末端标记法显示凋亡细胞。三、细胞凋亡过程与调控（一）、细胞凋亡的过程（四个阶段）1.凋亡信号转导2.凋亡基因激活3.凋亡的执行（由DNase和caspases执行）4.凋亡细胞的清除。凋亡过程Ⅰ受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+Dnase激活Caspases激活死亡信号凋亡过程Ⅱ执行凋亡凋亡细胞的清除Dnase激活Caspases激活凋亡过程小结+受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡诱导因素死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活Caspases激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞信号转导基因激活执行凋亡凋亡细胞的清除凋亡过程及分期

诱导期执行期消亡期

凋亡诱导因素受体cAMPCa2+神经酰胺死亡信号凋亡相关基因激活Dnase激活Capases激活巨噬细胞吞噬细胞凋亡细胞（二）、细胞凋亡的调控1.细胞凋亡的诱导因素与抑制因素(1)诱导因素（启动细胞凋亡）激素和生长因子失衡：二者过多或缺乏均可应起细胞凋亡。例：强烈应激反应糖皮质激素淋巴细胞凋亡。理化因素：电离辐射、高温、强酸、强碱、细胞毒性抗癌药等。免疫性因素：免疫细胞在生长、分化及执行防御、自稳、监视功能中,其免疫分子参与免疫细胞或靶细胞的凋亡过程。微生物因素：细菌、病毒及其毒素可诱导细胞调亡。如HIV可至CD4+，T淋巴细胞凋亡，是爱滋病的发病机理。(2)抑制因素（抑制细胞凋亡）

细胞生长因子：如IL-2、神经生长因子。

激素例：ACTH肾上腺皮质细胞增生抑制细胞凋亡

2、细胞凋亡信号的转导

凋亡诱导因素作用于细胞转化为凋亡信号胞内信号转导途径激活细胞死亡程序细胞凋亡（DNA片段化及蛋白解体）。

死亡受体通路：线粒体通路：诱导信号+配体诱导信号+配体+衔接蛋白诱导信号+配体（如Fas）+衔接蛋白+Procaspase-8（死亡诱导信号复合物）Procaspase-8激活为Caspase-8缺氧、缺血、酸中毒等原因线粒体膜通透性下降凋亡启动因子释放（cyt-c、Apaf-1等）cyt-c+Apaf-1+Procaspase-9Procaspase-9激活为Caspase-93.细胞凋亡的相关基因（1）抑制凋亡基因：Bcl-2（B细胞淋巴瘤\白血病-2基因）。Bcl-2(B-celllymphoma/leukemia-2)基因：分布：造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、多种瘤细胞。功能：抑制多种凋亡诱导因素（如电离辐射、化学药物）所引起的细胞凋亡（细胞增殖）。机制：*直接抗氧化而抑制细胞调亡；*抑制线粒体释放促凋亡的蛋白质；*抑制凋亡蛋白酶的激活；*维持细胞钙稳态。（2）促进凋亡基因：野生型p53基因——编码p53蛋白，故名。功能：促使恶性肿瘤细胞、衰老细胞或损伤较重的细胞凋亡，修复受损的细胞（分子警察）。

机制：射线、毒素DNA损伤+P53蛋白启动DNA修复机制DNA修复启动细胞凋亡机制细胞凋亡P53基因突变后反而抑制细胞凋亡,值得注意。

（3）双向调控基因：C.myc双向调节：诱导细胞增殖（有生长因子）诱导细胞凋亡（无生长因子）

四、细胞凋亡发生机制（一）氧化损伤（二）钙稳态失衡(三)线粒体损伤（四）细胞凋亡的分子机制氧化应激与自由基的损伤作用1.氧自由基攻击细胞膜上不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化直接造成细胞膜损伤，导致细胞凋亡。2.氧化应激可激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶及活化核转录因子如NF-kB，诱导细胞凋亡。3.氧化应激引起细胞膜结构的破坏，使Ca2+内流增加诱导细胞凋亡。4.激活P53基因，细胞调亡。

（一）氧化损伤（二）钙稳态失衡

1.激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶，降解DNA链；2.激活谷氨酰胺转移酶，使细胞骨架蛋白分子间发生广泛交联，有利于凋亡小体形成。3.激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录；4.Ca2+在ATP的配合下使DNA链舒展，暴露出核小体之间的连接区内的酶切位点，有利DNA内切酶切割DNA。（三）线粒体损伤

1.线粒体损失，导致ATP不足，线线体膜通透感性增高Ca2+浓度升高,均可启动细胞凋亡。2.膜电位下降，线粒体膜转换孔开放，通透性增加，细胞凋亡因子被激活，使细胞色素C，凋亡蛋白酶激活因子，凋亡诱导因子释放到细胞浆。1）细胞色素C+凋亡蛋白酶激活因子，激活Caspase-9,导致细胞凋亡。2)凋亡诱导因子激活核酸内切酶，增强Caspase-3活性导致蛋白水解。

（四）细胞凋亡的分子机制

●线虫(C.elegans)

●Caspase家族与凋亡●Bcl-2家族与细胞凋亡●细胞凋亡的分子机理

细胞凋亡受基因控制。线虫是研究细胞凋亡分子基础的理想材料。

每条线虫具有1090个细胞，其中在正常情况下有131个细胞在发育过程中以凋亡的方式死亡。从线虫中找到若干控制细胞凋亡的基因。1线虫(C.elegans)找到一系列与细胞凋亡有关的基因

ced-3、ced-4诱发、启动，促进细胞凋亡ced-9

基因阻止ced3/ced4的激活，抑制凋亡①

ced-3、ced-4基因突变或缺失，使凋亡受阻②移入ced-9使凋亡受阻③失去ced-9使细胞凋亡

2Caspase家族与凋亡

◆Caspase家族◆Caspase激活◆Caspase水解的靶蛋白

Ced3的哺乳类同源基因是ICE(Interleukin-1-convertingenzyme)，即Caspase-1。

Ced4的哺乳类同源基因是Apaf-1(细胞凋亡蛋白活化因子）。Ced9的哺乳类同源基因是BCL-2。Caspase家族是一组与众不同的蛋白水解酶，在凋亡早期阶段被激活，并负责引发随后的凋亡变化，通过切割一组高度选择性的必须蛋白质来实现这一功能。

Caspase活性位点是半胱氨酸(Cysteine)裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键因此称为Cysteineasparticacicspecificprotease，即CaspaseCaspase激活

细胞中合成的Caspase自身以无活性的酶原状态（Procaspase）存在，经激活后方能执行其功能。其激活依赖于其他的Caspase在它的天冬氨酸位点水解活化或自身活化胞外信号分子诱导的细胞凋亡途径

◆上游启始者Caspases切割、活化下游执行者Caspases

当细胞接受凋亡信号分子(Fas,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白(Adaptorprotein)结合，这些衔接蛋白又募集Procaspases聚集在受体部位，Procaspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡

◆下游执行者Caspases活化后，水解蛋白底物，启动凋亡

裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder;裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。3Bcl-2家族与细胞凋亡◆Bcl-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物，能抑制细胞凋亡；与线粒体及内质网膜相结合；Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的结构域；Bcl-2家族成员的基因中，常常含有三个保守的Bcl-2同源区，即BH1，BH2和BH3◆Bcl-2蛋白质家族成员以不同的方式调节细胞凋亡

促进凋亡:Bad、Bid、Bax阻止凋亡：Bel-X、Bel-w、Bel-2◆哺乳动物细胞中发现的Apaf2即是CytC正常机体细胞生长与死亡的平衡生长坏死、凋亡正常机体五、细胞凋亡与疾病

细胞凋亡与疾病的关系——该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。

细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病，

细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染不足与过度并存：动脉粥样硬化细胞凋亡与疾病凋亡相对不足肿瘤、自身免疫性疾病、病毒感染等（一）细胞凋亡不足1.肿瘤细胞增殖过度、细胞凋亡不足。实验研究：

P53基因（促凋亡基因）缺失或突变Bcl-2基因（抑制凋亡基因）表达过度临床应用：放疗、化疗诱导瘤细胞凋亡

细胞凋亡不足肿瘤2.自身免疫病机体对自身抗原发生免疫应答——自身组织损伤。针对自身抗原免疫细胞凋亡不足——自身免疫病。例：1型糖尿病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、慢性甲状腺炎。临床应用：糖皮质激素——诱导自身免疫性淋巴细胞凋亡。细胞凋亡过度神经退行性疾病、造血衰竭性疾病、心肌缺血/再灌注损伤（二）细胞凋亡过度1.心血管疾病（1）急性心肌梗死，坏死与凋亡同时存在（2）心力衰竭与心肌细胞功能异常及凋亡有关实验研究：心肌细胞肥大压力负荷