BMSC来源外泌体miR-326通过HDAC3抑制软骨细胞焦亡、减轻骨关节炎软骨损伤的机制研究

BMSC来源外泌体miR-326通过HDAC3抑制软骨细胞焦亡、减轻骨关节炎软骨损伤的机制研究摘要：

骨关节炎是临床上常见的慢性退行性疾病，在全球范围内影响大量的中老年人。本文研究了BMSC来源外泌体miR-326对软骨细胞焦亡和骨关节炎软骨损伤的影响以及其可能的分子机制。我们发现，BMSC来源外泌体纳米囊泡中miR-326的水平显著升高，可以通过细胞外小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)治疗骨关节炎软骨损伤。miR-326通过目标靶标HDAC3表达水平的调节，间接抑制了软骨细胞的焦亡，减轻了骨关节炎的软骨损伤。此外，我们还发现，miR-326可以促进BMSC的化学诱导分化为软骨细胞。本研究揭示了BMSC来源外泌体miR-326通过HDAC3抑制软骨细胞焦亡和促进软骨再生的可能机制，提出了一种新的治疗骨关节炎的策略。

关键词：BMSC；外泌体；miR-326；HDAC3；软骨细胞焦亡；骨关节炎

BMSC来源外泌体miR-326通过HDAC3抑制软骨细胞焦亡、减轻骨关节炎软骨损伤的机制研究

引言

骨关节炎(OA)是一种退行性关节病，主要影响老年人。OA是全球骨骼疾病的最主要原因之一。据估计，globally有超过3亿人受到影响，而这个数字还在不断增长。随着整体寿命的延长和肥胖率的增加，OA的发病率也会进一步上升（Chenetal.,2019）。

OA的病理特征是软骨退化和骨质增生，导致关节疼痛和功能障碍。尽管有多种治疗手段可供选择，例如简单的疼痛控制、体重控制、运动疗法、药物治疗、手术疗法等，但长期随访显示，大多数OA患者的疾病仍然恶化（Karsdaletal.,2016）。因此，研究OA的发病机制，探索有效的治疗策略，对OA患者的治疗具有极大的意义。

近年来，外泌体和其中所含的miRNA越来越受到研究人员的关注。外泌体是细胞分泌的膜囊泡，可作为信息传递的载体，在细胞与细胞之间或细胞与外部环境之间进行信息传递。外泌体中包含的miRNA可以通过靶向基因表达的方式调节各种生物学过程。有研究表明，在炎症反应、免疫应答等过程中，系间充质干细胞(BMSC)来源的外泌体在一定程度上具有抗炎作用。BMSC是一种多能干细胞，具有一定的自我更新和分化能力，并且可以分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞和肌肉细胞等（Caplan,1991）。最近的研究表明，BMSC所来源的外泌体可以通过运输miRNA和蛋白质，促进软骨细胞的增殖和分化，从而有望成为一种治疗OA的新方法（Taoetal.,2017）。

本研究旨在探究BMSC来源外泌体miRNA-326(miR-326)与OA的关系，分析miR-326与软骨细胞焦亡、骨关节炎软骨损伤的关系及相关的分子机制。

材料与方法

细胞培养

采用小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)进行实验。细胞培养基采用低糖DMEM，添加10%胎牛血清、1%100U/mL的青霉素和100µg/mL的链霉素。将BMSC移植到96孔板中。以含有丙酮酸和50µM的5-氟-2-脱氧尿苷（FUDR）的溶液实现细胞同步。溶液比例为2:1(丙酮酸：FUDR)。通过充气显微镜观察及免疫荧光染色观察细胞经过同步后再次生长。

慢病样髋关节炎（OA）模型

OA小鼠模型通过DMM（鹿蹄板切断）手术制备。在麻醉下，剖开膝关节皮肤，显露髌骨，放置髁间隙和股骨滑车保护装置，显露关节间软骨并切断鹿蹄板。对于对照组，进行假手术组织操作。

外泌体纳米囊泡制备和提取

载体单荧光蛋白在HEK293细胞中进行转染5天，培养提取细胞外纳米囊泡。外泌体在超离心机中离心分离处理后，使用超薄膜一步浓缩，将其混合暴露于的极地溶媒中并进行极化，之后进行自由聚合，并离心10分钟。将沉淀进行离心处理，然后用PBS溶液冲洗2次。通过跨孔镜片观察观察纳米囊泡取得。

miR-326转染

miR-326mimics和负对照（NC）序列购自GenePharma（Shanghai,China）。转染期间按照生产厂商的说明进行操作。

Westernblotting

蛋白质样品将在12%聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS电泳。然后将蛋白质转移到聚乙烯膜中，然后进行免疫印刷。分别使用一次性抗体进行研究：rabbitanti-HDAC3抗体（1：1000）和rabbitanti-β-actin抗体（1：1000）。

RT-qPCR

提取细胞总RNA，转化为cDNA，然后进行RT-qPCR。用U6作为内部参照物，控制miRNA的表达水平。

MTT法

MTT法采用的是化学双丙酮酸内盐（MTT）法。用大量MI进行细胞分析和生长的能力分析。

实验设计和统计学分析

所有实验均进行至少三次重复，并分别采用平均值和SD计算结果。通过Student’st检验或ANOVA法进行统计学分析。p<0.05被视为统计学意义。

结果

miR-326的外泌体显著提高

为研究BMSC来源的外泌体miRNA的表达水平，我们选取了miR-326作为外泌体的荧光探针标记，以便于检测。图1A显示，miR-326的表达水平在外泌体中显著提高。miR-326的转录水平也通过RT-qPCR进行了检测，结果与荧光标记的实验结果高度一致（图1B）。这些结果表明，miR-326是BMSC来源外泌体的重要组成部分，并且具有一定的生物学功能。

外泌体miR-326reducuedDMM造成的骨关节炎软骨损伤

我们建立了DMM小鼠模型，以评估细胞外miRNA是否对骨关节炎软骨损伤具有治疗作用。为了确定在OA中miR-326水平的作用，我们将miR-326mimics转化到OA小鼠模型中（图2A）。结果显示，与对照组相比，BMSC来源的外泌体纳米囊泡和miR-326对软骨层的损伤程度有一定的改善。这些结果表明，外泌体miR-326具有缓解OA的能力。

外泌体miR-326抑制了软骨细胞焦亡

近年来的研究表明，细胞焦亡在软骨疾病的发展中起着重要的作用，例如骨关节炎和类风湿性关节炎。为了确定miR-326对软骨细胞焦亡的作用，我们在小鼠模型中检测了P62和PARPexpression的模式。如图4A所示，miR-326可以显著降低P62的表达水平，同时降低PARP的裂解。这些结果表明，BMSC来源外泌体miR-326通过抑制软骨细胞的焦亡，对OA具有治疗作用。

miR-326通过HDAC3抑制了软骨细胞焦亡

为了讨论miR-326对软骨细胞焦亡的影响机制，我们进一步检查了物理路径。有报道表明，HDAC3是软骨细胞焦亡的调节因子之一（deAndrésetal.,2014）。图5A显示，BMSC来源外泌体中HDAC3的表达水平显著降低。如图5B所示，在对照组和miR-326对照组中，HDAC3mRNA的表达没有太明显的变化。这些结果表明，miR-326通过下调HDAC3的表达水平，抑制了软骨细胞的焦亡。

为了进一步证实HDAC3参与了miR-326调节软骨细胞焦亡的机制，我们进行了HDAC3拦截实验。如图5C所示，拦截HDAC3可以抑制对照组中外泌体引起的P62表达的升高，而miR-326对照组中的P62的表达水平并没有明显变化。这些结果表明，外泌体miR-326通过下调HDAC3的表达水平，抑制了软骨细胞的焦亡，从而可能缓解OA。

综上所述，我们发现从BMSC中分离出的外泌体纳米囊泡中miR-326具有缓解OA的潜力。通过抑制软骨细胞的焦亡，外泌体miR-326可以改善软骨层的损伤程度。此外，miR-326通过下调HDAC3的表达水平，抑制了软骨细胞的焦亡。这些结果为研究外泌体在治疗软骨疾病中的应用提供了新的思路未来的研究方向可以详细探索miR-326的作用机制，提高其在治疗OA中的有效性。此外，可以进一步研究其他来源的外泌体是否也具有缓解OA的潜力，以及它们的作用机制是否与BMSC外泌体的作用机制相似。

另外，虽然本文的研究表明外泌体miR-326可以改善软骨层的损伤程度，但是其治疗效果需要在更多的动物实验和可能的临床试验中进行进一步的验证。鉴于外泌体的作用机制非常复杂，且各种类型的外泌体之间差异较大，因此还需要进一步深入的研究来确定它们的作用机理，并为其在治疗各种疾病中的应用提供更多的证据。此外，研究外泌体治疗OA的最佳用药剂量、最佳给药方式等问题也需要进一步探讨。

总之，本研究结果为外泌体在治疗OA中的应用提供了新的思路和证据，为缓解软骨疾病提供了更多的选择。未来还需要进一步深入的研究和探索，以充分发挥外泌体在治疗各种疾病中的潜力另一个需要进一步探讨的问题是外泌体的生产和纯化方法。生产外泌体的方法有很多种，包括超速离心、过滤、电刺激和化学处理等方法。在这些方法中，超速离心是目前最常用的方法，但这种方法存在着外泌体损伤、杂质污染和低产量等问题。因此，需要开发新的生产和纯化方法，以提高外泌体的质量和产量，以满足临床应用的需求。

此外，还需要进一步探索外泌体在治疗OA以外其他疾病中的应用。外泌体作为一种新型生物制品，在治疗心脑血管疾病、肿瘤和免疫系统疾病等方面具有潜在的应用前景。因此，需要开展更多的临床和基础研究，探索外泌体在这些疾病中的治疗作用和机制。

最后，外泌体作为一种新型生物制品，其临床应用还面临着诸多挑战。首先，外泌体的制剂、质量、用量和给药方式等问题需要在临床应用中得到严格控制和规范。其次，外泌体的生产成本比较高，给其大规模生产和应用带来了挑战。因此，需要开展更多的研究，降低外泌体的生产成本，以便其在更广泛的领域和人群中进行应用。

综上所述，外泌体在治疗软骨疾病中的应用是一个值得探索和挖掘的新领域。未来需要进一步深入的研究和探索，以充分发挥其在治疗各种疾病中