蛋白芯片技术的研究现状

为了实现这个目的，首先必须通过一定的方法将蛋白质固定于合适的载体上，同时能够维持蛋白质的天然构象，也就是必须防止其变性以维持其原有特定的生物学活性。另外，由于生物细胞中蛋白质的多样性和功能的复杂性，开发和建立具有多样品并行处理能力、能够进行快速分析的高通量蛋白芯片技术将有利于简化和加快蛋白质功能研究的进展。当前1页，总共72页。当前2页，总共72页。当前3页，总共72页。当前4页，总共72页。当前5页，总共72页。当前6页，总共72页。蛋白芯片技术的研究现状日本学者Velev利用含有阳离子表面活性剂（HTAB）脂质体作为载体，通过戊二醛作用使其与一种铁蛋白包裹外壳的成分结合组装制备成为一种纳米水平的装配体，这种装配体可以在适当的pH条件下，使铁蛋白分子进入并固定于包裹外壳内面，形成蛋白质的载体。当前7页，总共72页。Adachi等利用某些固体表面或薄膜覆盖上含有电解质的薄膜作为载体，可以将胶体蛋白质颗粒成分转移至薄膜上形成蛋白芯片。Uetz等在分析啤酒酵母基因组序列全长度阅读框架编码各种蛋白质的相互作用的过程，使用不同孔数的平板作为载体，建立了约含有6000个酵母转化株组成的平板蛋白芯片系统，平板上的每一个小孔中含有一个酵母转化株，可以根据其活性功能区开放阅读框架的编码表达生成一种蛋白质，利用这个系统可以用于蛋白质功能的检测和分析。当前8页，总共72页。Arenkov等利用聚丙烯酰胺凝胶板作为支持物，将蛋白样品置于凝胶上，然后经过电泳分离，使其成为蛋白的阵列用于进一步的研究。哈佛大学蛋白芯片研究中心Gavin等利用制备DNA芯片的高精密度机械手的针状点样枪头在只有显微镜载玻片一半大小的玻片上，制备了第一张含有样品点数为10800的蛋白芯片。这张芯片用已纯化的蛋白，按每点为1纳升的点样量点样10799次，当前9页，总共72页。另一次用FRB（FK-BR12-rapamycinbindingdomainofFKBP-rapamycin-associatedprotein）点样。为了确保不同分子量的点样蛋白质都能够被固定在玻片上，他们首先在玻片表面涂上BSA，然后使用N，N'-二琥珀酰胺碳酸（N，N'-disuccinimidylcarbonate）激活BSA表面的赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基成为BSA-NHS玻片，其作用是促进BSA与点样蛋白质的结合而使蛋白质被固定于玻片上。当前10页，总共72页。在制备芯片过程中，为了保证被固定在载体上的蛋白质依然保持天然的构象和生物学活性，在蛋白质点样的磷酸盐缓冲液中加入40%的甘油，以防止因汽体的蒸发而造成的蛋白质变性。点样后再经3h的温浴并将芯片浸泡于含有小牛血清蛋白（BSA）的缓冲液中，使芯片表面含有一层小牛血清蛋白，用于封闭与其他蛋白质产生非特异性结合的部位及在表面未参加反应的醛基（封闭）。当前11页，总共72页。为了检测芯片的应用，他们用不同荧光抗体分别标记能与蛋白G和FRB特异结合的IgG和FKBP12（12KdFK506-bindingprotein）并作用于蛋白芯片，观察这些蛋白质与蛋白芯片的相互作用，其结果清晰地显示芯片上的蛋白G和单一的FRB点样分别被标上蓝色和红色荧光。该实验研究建立了蛋白质样品微量点样技术并使蛋白质固定于载体上时能够保留原有的构象和生物学活性，这将为今后对蛋白质多样品的并行研究或快速分析--为制备高通量功能检测的蛋白芯片奠定了技术基础。当前12页，总共72页。蛋白芯片的应用研究Holt等利用蛋白芯片技术筛选能够相互结合的特异抗体抗原成分，他们利用12种表达较强但尚未接触任何抗原的抗体片段筛选含有27648种人胎脑蛋白的蛋白芯片，从中找出了4组高度特异性的抗原（蛋白）-抗体复合物，其中有3种抗体结合的蛋白质功能未明，但是由于表达水平都较低，说明这种抗原-抗体的结合技术是一种具有较高特异性和敏感性的筛选方法，可以用于高通量筛选分离各种不同的抗体成分，或检测基因的表达和蛋白分子间的相互作用，这将有助于对某些疾病（包括肿瘤）的发病分子机理的研究，以及协助寻找疾病诊断和治疗的靶分子。根据蛋白芯片技术的基本原理，可以将不同的抗体固定于载体上成为抗体蛋白芯片，用于检测不同组织产生的蛋白质。当前13页，总共72页。Ge在蛋白质的相互作用的研究中，采用了一种通用的蛋白质芯片系统，该系统敏感有效，用途广泛，可定量测定及重复使用，而且操作简易。Gavin等应用蛋白芯片技术观察代谢过程有关作用物和酶的相互作用关系。他们选择三对激酶-作用物系统，即依赖3'，5'-磷酸蛋白激酶-Kemptide；蛋白激酶Ⅱ-蛋白质磷酸酶抑制因子2和p42促有丝分裂激活蛋白（MAP）激酶（ErK2）-E1K1，首先将各系统的作用物按顺序固定于三张BSA-NHS玻片上，分别在有同位素γ-33PATP的环境中，与不同蛋白激酶温浴，然后，玻片经用乳剂处理后可在光镜下观察到各种蛋白激酶催化特异的作用物产生磷酸化反应。其结果提示蛋白芯片技术可以应用于作用物与酶相互作用的研究及代谢机制的分析。当前14页，总共72页。Gavin等还在蛋白芯片技术研究过程通过DIG、生物素和合成的六氢吡喧酮胺（即AP1497）等三种具有对应的蛋白受体的小分子特质，研究蛋白的受体蛋白按顺序固定的相互作用。他们首先将三种小分子物质的受体蛋白按顺序固定于同一载体上并制备成为相同的四张蛋白芯片，将BSA分别用荧光物质（Alexa488、Cy3或Cy5）标记，并分与DIG、生物素和AP1497三种小分子物质结合成为探针，用每一种具有不同荧光标记的探针作用芯片，结果只有能与小分子对应的受体蛋白被标上荧光。上述结果说明使用的荧光剂之间没有交叉的荧光激发和发光作用，因此，将三种标记探针混合后作用于蛋白芯片，则可使三种不同的受体蛋白同时标记上不同的荧光。研究结果提示蛋白芯片技术对于新药的发掘是十分有用的，因为它对寻找新药作用的靶点非常方便。当前15页，总共72页。存在的问题及应用前景虽然目前已经成功地制出了第一张具有高通量分析作用的蛋白芯片，通过适当的技术处理可以使点样蛋白保持天然的构象和生物学活性。但是，利用蛋白芯片技术对于蛋白质功能的研究仍然存在着种种问题，例如目前大多数来自于cDNA文库的克隆体系不能通过正确的阅读框架编码蛋白质；或者不能正确表达产生具有氨基酸全序列的蛋白分子；通过细菌表达的蛋白质不能形成正常的空间构象等，都将直接影响有关蛋白质功能的研究。另外，为了方便种类繁多的蛋白质的功能检测和分析，通过不同途径或方式获取并用于制作蛋白芯片的蛋白质必须首先经过纯化。正常和异常情况下蛋白质与蛋白质之间的相互作用的差别都需要我们进一步去探索。当前16页，总共72页。高通量分析平台蛋白芯片技术的建立将为蛋白质功能及其相关的研究提供快速、高信息量和更为直接的研究方法，与其他的分子生物学分析方法相比，蛋白芯片技术具有快速、平行的优越性。该方法的建立和应用将有助于人类揭示疾病发生的分子机制及寻找更为合理有效的治疗手段和途径。当前17页，总共72页。蛋白质芯片的意义1、蛋白质是基因表达的最终产物，接近生命活动的物质层面；2、探针蛋白特异性高、亲和力强,可简化样品前处理，甚至可直接利用生物材料（血样、尿样、细胞及组织等）进行检测；3、适合高通量筛选与靶蛋白作用的化合物；4、有助于了解药物或毒物与其效应相关蛋白质的相互作用。当前18页，总共72页。蛋白质芯片的分类：1、蛋白质检测芯片；2、蛋白质功能芯片。当前19页，总共72页。蛋白质芯片的制备1、固相载体及其处理（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）；2、蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解；3、点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等；4、膜为载体：芯片放入湿盒，37℃1h；载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白；5、微阵列的封闭固定微阵列上的蛋白样点，主要封闭试剂：BSA或Gly。当前20页，总共72页。液相蛋白芯片技术及其应用进展液相蛋白芯片技术由美国Luminex公司研制开发并于2O世纪9O年代中期发展起来，是在流式细胞技术、酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)技术和传统芯片技术基础上开发的新一代生物芯片技术和新型蛋白质研究平台。液相蛋白芯片技术推动了功能基因组时代的蛋白质研究，相关的仪器、分析软件以及试剂盒研发备受瞩目并已形成一定的市场规模。当前21页，总共72页。当前22页，总共72页。当前23页，总共72页。液相蛋白芯片技术的基本原理液相芯片技术在国际上被称之为xMAP(flexibleMultilyteProfiling)技术，其核心技术是乳胶微球包被、荧光编码以及液相分子杂交。液相芯片体系以聚苯乙烯微球(beads)为基质，微球悬浮于液相体系，每种微球可根据不同研究目的标定上特定抗体或受体探针，可对同一样品中多个不同的分子同时进行检测。微球表面可进行一系列修饰以适合固定各种蛋白、多肽或核酸等生物分子。xMAP技术可应用于蛋白或核酸的功能及其相互作用研究，分别称之为液相蛋白芯片技术和液相基因芯片技术。当前24页，总共72页。液相蛋白芯片体系主要包括微球、蛋白探针分子、被检测物和报告分子四种成分。在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种用于标记探针的微球都带有独特的色彩编码，其原理是在微球中掺入不同比例的红色分类荧光及发色剂，可产生100种颜色差别的微球，可标记上100种探针分子，能同时对一个样品中多达100种不同目标分子进行检测。反应过程中，探针和报告分子都分别与目标分子特异性结合。结合反应结束后，使单个的微球通过检测通道，使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光和报告分子上的绿色报告荧光进行检测，可确定所结合的检测物的种类和数量。当前25页，总共72页。当前26页，总共72页。当前27页，总共72页。液相蛋白芯片技术的特点液相蛋白芯片技术有机地整合了微球、激光检测技术、流体动力学、高速的数字信号处理系统和计算机运算功能，不仅检测速度极快，而且在免疫诊断以及蛋白质分子相互作用分析方面，其特异性和敏感性往往也超越常规技术。当前28页，总共72页。1、反应快速，灵敏度高。反应环境为液相、微球上固定的探针与待检样品均在溶液中反应，其彼此间碰撞几率与速度相对于固相芯片或ElISA等反应模式，可增加1O倍以上，因此可提高反应速度及灵敏度。抗原一抗体等蛋白质分子相互作用的结果可在瞬间经激光判定后由电脑以数据信息的形式记录下来，敏感性显著超越酶联信号或常规杂交信号检测。当前29页，总共72页。2、通量大，可同时检测多种目标物，所需成本较低，减少人力消耗，可对同一样品中多达100种分子同时进行分析。液相芯片系统采用96孔板为反应容器，在35-60min内，可对96个不同的样品进行检测，所需样品用量比常规方法少。3、可进行多元化分析，灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，应用广泛。通过对微球表面的修饰，可固定各种抗体或受体分子，从而满足不同检测和功能的研究需要。当前30页，总共72页。4、采用接近生物系统内部环境的完全液相反应体系，稳定性好。液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，不仅有利于探针和被检测物的反应，也更能保证反应的特异性和稳定性。5、操作简便，不需洗涤，耗时短。常规ELISA或固相芯片技术，每一步反应之后都需充分洗涤以去除非特异结合成分，耗时且易造成污染。而液相芯片技术可以避免这些过程和弊端。当前31页，总共72页。蛋白芯片在免疫诊断和分析领域的应用蛋白芯片系统适用于蛋白质组学研究，临床研究和药物研究中的各种蛋白质分析，已被应用于细胞因子和激酶的检测、抗原决定簇的筛选、多种蛋白质过敏原检测、传染病快速诊断以及与各种抗原、抗体反应相关的检测当中。在免疫诊断与分析研究应用方面，全球已有上百篇公开发表的论文和研究报道，主要可归纳为以下几方面。当前32页，总共72页。1、传染病的快速检测和疾病诊断：xMAP液相蛋白芯片免疫诊断方法又称为微球免疫方法(micro-sphere

immunoassay)，国内外已建立多种微球免疫方法用于人和动物传染病快速检测以及人类疾病诊断研究。当前33页，总共72页。Yan等建立微球免疫检测方法进行流感病毒检测和分型，并与EusA方法比较，结果表明微球免疫法对流感病毒粒子和重组血凝素抗原的检测敏感性均提高了10倍。Wong等建立微球免疫方法快速检测西尼罗病毒（WestNilevirus），并能与登革热病毒感染、圣路易斯脑炎(St．Lousisencephalitis)病毒感染以及黄热病(flavivirus)免疫鉴别开。Biagini等应用液相蛋白芯片技术检测人群血样中抗炭疽IgG抗体，并与ELISA方法相比较，结果表明，前者更加敏感和快速，稳定性好，样品用量少，检测动力学范围广。当前34页，总共72页。Biagini等还建立蛋白芯片方法同时检测血清中23种血清型的肺炎球菌荚膜多糖抗体。Pickering等将蛋白芯片检测免疫方法应用于检测破伤风(tetanus)、白喉(diphtheria)以及B型嗜血性流感杆菌(haemophilusinfluenzatypeB)疫苗免疫抗体，并与ELISA方法相比较。对81份样品，两种方法对三种疫苗抗体的检测符合率可达91%-96%，而蛋白芯片方法能减少人力和试剂消耗，并缩短检测时间。当前35页，总共72页。在定量检测方面，国外也有报道。Dias等建立蛋白芯片方法，用于定量检测抗人乳头瘤病毒6、11、16和18型中和抗原的抗体，并根据检测结果确定用于临床诊断判定的抗体阈值。Lal等建立蛋白芯片免疫检测方法，用于同时定量检测抗9种血清型肺炎链球菌的IgG抗体，研究表明，蛋白芯片方法可用于肺炎链球菌疫苗免疫效果的评估。当前36页，总共72页。国外还有报道建立蛋白芯片方法用于检测艾滋病病毒抗体、疱疹病毒抗体、麻疹和腮腺炎抗体、弓形虫抗体、呼吸道合胞病毒抗体、类风湿因子等以及一种人类医学紊乱症--乳糜泻(celiacdiseases)的诊断。当前37页，总共72页。2、细胞因子检测与研究：应用蛋白芯片技术可对微量样品同时定量检测多种细胞因子。在人细胞因子的检测和研究方面，蛋白芯片技术的应用目前已有多篇报道。当前38页，总共72页。Skogstrand等应用蛋白芯片技术同时检测新生儿干血点样品(driedbloodspotsamples，DBSS)中25种细胞因子。新生儿炎症反应可能与脑瘫、自闭症和糖尿病等一些迟发的疾病有关，对新生儿进行炎症因子检测将有助于上述疾病的病原学研究。通常采用DBSS（Dilutingbuffersolutionforserum）样品进行检测，由于样品量少，采用常规免疫学方法对一份样品难以检测多种因子。而蛋白芯片方法可解决这个问题。采用蛋白芯片对储存20年以上的样品进行检测，仍能检测到大多数细胞因子。研究表明，蛋白芯片应用于检测DBSS样品中的细胞因子是可靠的，在新生儿疾病筛查方面应用潜力大。当前39页，总共72页。Gorelik等应用蛋白芯片检测人体中24种细胞因子的浓度水平，以研究细胞因子水平与卵巢癌早期诊断的关系。研究人员对卵巢癌早期患者、健康人群和良性骨肿瘤患者的血样，同时检测多种细胞因子和癌症抗原(CA-125)并比较其浓度水平。结果显示，CA-125以及白细胞介素IL-6、IL-8等6种标记物的浓度水平在卵巢癌早期患者和健康人血样中有显著差异。研究表明，应用蛋白芯片检测上述标记物的浓度变化可作为卵巢癌早期诊断的手段。当前40页，总共72页。Johannisson等应用蛋白芯片方法检测猪促炎症细胞因子（proinflammatorycytokines），灵敏度可达0.18-12ng／ml。这是首次报道采用蛋白芯片技术检测动物体内细胞因子。当前41页，总共72页。3、抗核抗体、抗多肽抗体检测、抗体应答等免疫分析研究：Rouquette等应用蛋白芯片检测试剂盒定量检测了9种抗核抗体(antinuclearantibodies)，并与常规ELISA和免疫荧光试剂盒相比较，对222例血清样品的检测结果表明，蛋白芯片方法与常规方法的检测符合率介于99.1%-100.0%。Komatsu等建立蛋白芯片方法，用于检测抗多肽抗体，以监测多肽疫苗的免疫应答情况；检测表明，蛋白芯片方法的敏感度与商品化ELISA试剂盒相当，但前者所需样品量少，检测时间缩短，成本较低。当前42页，总共72页。Khan等建立蛋白芯片方法，用于进行淋巴细胞胞内信号通道研究。该方法可以检测信号转导过程中T细胞和B细胞胞内发生的信号蛋白磷酸化动力学变化，从而可揭示淋巴细胞信号通道的作用机制。试验表明，蛋白芯片方法可同时检测多种信号蛋白的动力学动态变化过程。Williams等应用蛋白芯片方法检测患者血样中多种异嗜性抗体(heterophilantibodies)，分析了艾滋病免疫检测中假阳性反应产生的原因，为排除假阳性反应提供了解决方法。当前43页，总共72页。研究人员建立了同时检测抗牛、羊、鼠以及牛血清白蛋白IgG抗体的蛋白芯片方法，对多例患者血清进行检测试验，结果表明，在常规检测中出现非特异性染色反应的样品，均不同程度存在上述异嗜性抗体。将样品事先与上述抗体孵育后再进行蛋白芯片检测或ELISA常规检测，可以排除非特异反应。当前44页，总共72页。细胞芯片细胞芯片为医学分子生物学提供了一种高通量、大样本以及快速的细胞分子水平的分析工具。它克服了传统细胞学方法和基因芯片、蛋白芯片技术中存在的某些缺陷，使人类可有效利用成百上千个自然或处于特定状态下的细胞株或细胞系来研究特定基因及其所表达的蛋白质与疾病之间的相互关系，对于科研、开发、疾病的分子诊断、预后分析、药物治疗靶点的筛选、组织分布、细胞定位、抗体药和新药的筛选等方面均有十分广泛的实用价值。它的出现，将从根本上改变临床检测的观念和效率，并为创建新的肿瘤早期检测方法提供参考方向。当前45页，总共72页。细胞芯片用途：

1．免疫细胞化学2．原位杂交与原位PCR3．基因与蛋白的表达和调控4．单抗的筛选与鉴定5．药物的筛选与鉴定6．肿瘤的研究当前46页，总共72页。细胞芯片特点：1,特异性及灵敏度高2,高通量3,适用范围广4,操作简便灵活5,结果可靠6,便于设计各种试验对照7,可以进行自动化分析当前47页，总共72页。细胞芯片可以广泛的与核酸，蛋白质，细胞，组织，微生物技术相结合，分别在基因，转录和表达产物的这三个水平进行生物学功能研究。结合显微镜技术检测探针分子杂交信号的强度，利用计算机综合分析后，可获得样本中特定基因及相关蛋白的表达信息。当前48页，总共72页。当前49页，总共72页。当前50页，总共72页。当前51页，总共72页。当前52页，总共72页。当前53页，总共72页。当前54页，总共72页。当前55页，总共72页。当前56页，总共72页。当前57页，总共72页。血细胞免疫分型细胞芯片免疫分型细胞芯片，用于检测细胞表面CD（Clusterofdifferentiation）抗原，又称作细胞膜表面的分化抗原群/分化抗原簇，近来，他又被称作人类细胞分化分子(HCDM)。可大致划分为T细胞、B细胞、髓细胞、NK细胞、血小板、粘附分子、内皮细胞、细胞因子受体、激活抗原、碳水化合物半抗原、树突状细胞、干细胞／祖细胞、基质细胞和红细胞14个组。检测CD抗原是实验室识别细胞及不同分化阶段细胞或细胞亚群最主要的方法。当前58页，总共72页。当前59页，总共72页。细胞芯片CD13阳性扫描及流式细胞图当前60页，总共72页。细胞芯片CD19阳性扫描及流式细胞图当前61页，总共72页。当前62页，总共72页。分化抗原参与机体重要的生理和病理过程：①免疫应答过程中免疫细胞的相互识别，免疫细胞抗原识别、活化、增殖和分化，免疫效应功能的发挥；②造血细胞的分化和造血过程的调控；③参与炎症反应、血栓形成和组织修复；④参与细胞的生长、分化、迁移，及肿瘤的恶化和转移。当前63页，总共72页。基础免疫学研究中主要应用于：①CD抗原的基因克隆，新CD抗原及新配体的发现；②CD抗原结构与功能关系；③细胞激活途径和膜信号的传导；④细胞分化过程中的调控；⑤细胞亚群的功能。当前64页，总共72页。CD在临床免疫学研究中主要用于：①机体免疫功能的检测；②白血病、淋巴瘤免疫分型；③免疫毒素用于肿瘤治疗、骨髓移植以及移植排斥反